APP下载

大豆蛋白凝胶显微结构研究

2012-12-02于翠柳陈野李秀明郭立华张宁

食品研究与开发 2012年9期
关键词:凝固剂戊二醛谷氨酰胺

于翠柳,陈野,李秀明,郭立华,张宁

(天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457)

许多大豆食品的加工是利用大豆蛋白的凝胶化制作的,例如制作豆腐、酸乳酪等[1],大豆蛋白凝胶的形成与多种因素有关,如大豆的化学性质、豆浆中的固形物的含量[2]及凝固剂的浓度[3]等,许多科研人员研究了大豆蛋白凝胶的形成机理,李里特[4]等研究了豆腐的加工工艺以及盐类凝固剂的凝固特性与作用机理,考察了基本的加工条件对豆腐凝胶强度的影响。大豆蛋白凝胶形成的实质就是大豆蛋白在凝固剂的作用下相互结合,形成三维网络结构,将脂肪、水等成分包容在一起[5],这研究的是大豆蛋白凝胶的综合特性。凝胶的形成有众多的影响因素,为了减小脂肪、糖等成分对凝胶网络结构的影响,本实验采用大豆分离蛋白作为原料来制备大豆蛋白凝胶,研究其凝胶形成特性。大豆蛋白凝胶的工艺以及工艺参数对凝胶质构影响的研究已经很多,但这些条件对凝胶显微结构影响研究还不深入,本文采用盐卤、葡萄糖酸内酯和转谷氨酰胺酶作为凝固剂制备大豆蛋白凝胶,采用戊二醛和乙醇作为固定剂来固定凝胶的结构,冷冻干燥后测定其硬度并观察其显微结构。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白:平顶山植物蛋白有限公司。

盐卤:天津利民调料有限公司;葡萄糖酸内酯(GDL):江苏康力生物科技发展有限公司;转谷氨酰胺酶(TGase):江苏一鸣生物制品有限公司;戊二醛:天津博迪化工股份有限公司;乙醇:天津市江天化工技术有限公司(均为分析纯)。

1.1.2 仪器

KDM型调温电热套:A型,山东省鄄城永兴仪器厂;HH数显恒温水浴锅:金坛市金城国胜实验仪器厂;MODULYOD-230型冷冻干燥机:美国热电公司;TAXT plus型物性分析仪:北京微讯超技仪器技术有限公司;SU1510型扫描电子显微镜:日本那珂事业所。

1.2 方法

1.2.1 大豆蛋白凝胶的制备

配制质量比为6%的生蛋白溶液,加热至100℃并保持10 min,得到熟蛋白溶液。

取300 mL熟蛋白溶液在500 mL的烧杯中,与不同浓度(质量体积比分别为0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%)的盐卤混合3 min,将混合物迅速转移到80℃的水浴锅中保温凝固30 min,制得盐卤处理的大豆蛋白凝胶,然后快速冷却到20℃,最后储放在4℃冷藏箱内备用。

另取30℃以下300 mL熟蛋白溶液在500 mL的烧杯中,与不同浓度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mol/L)的葡萄糖酸内酯混合3 min,其他的操作同盐卤,制得葡萄糖酸内酯处理的大豆蛋白凝胶。

取300 mL、50℃熟蛋白溶液倒入含有转谷氨酰胺酶(10、20、30、40、50 kat/g)的烧杯中,将其置于 50 ℃的水浴锅中3 h。制得转谷氨酰胺酶催化的大豆蛋白凝胶。

1.2.2 大豆蛋白凝胶的固定和干燥

大豆蛋白凝胶切成长条(65 mm×15 mm×15 mm),在一定浓度的固定剂溶液(不同浓度的戊二醛或100%乙醇)中固定24 h。用pH7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次,每次10min。用体积分数分别为30%、50%、70%、85%、95%、100%的乙醇梯度脱水,每种浓度的乙醇各处理10 min。经脱水后,用冷冻干燥机进行干燥。

1.2.3 扫描电镜观察

干燥后的凝胶置于液氮中脆断,处理好后粘在金属样品台上,断裂面向上,采用离子溅射方法镀金,镀金的条件为15 kV、15 mA、1.5 min。然后将样品置于扫描电子显微镜(15 kV)下观察其显微结构。

1.2.4 大豆蛋白凝胶硬度测定

冷冻干燥后的大豆蛋白凝胶放在物性分析仪上做硬度实验,采用A/WEG探头(30°角精细锲型刀具),测试速度为2.0 mm/s,凝胶硬度是指探头切断凝胶时所受到的最大的力,仪器读数单位为g。每种凝胶测定5次。

2 结果与讨论

2.1 处理方法对凝胶显微结构的影响

2.1.1 凝固剂对凝胶显微结构的影响

表1表示的是选取任意不同的凝固剂处理的凝胶样品单位面积(1μm2)内网孔的个数以及直径。

表1 不同的凝固剂处理下的凝胶网络中网孔的个数及直径Table 1 Number and diameter of holes in the gel network treated by different coagulants

从表1可以看出,随着盐卤的加入,网孔的个数增多,这是因为盐卤中的高价阳离子与大豆蛋白表面带负电荷的氨基酸残基结合,从而使蛋白质间的静电斥力减弱,当大豆蛋白溶液中的盐离子达到凝固浓度时,蛋白质之间的斥力和引力达到平衡,蛋白质结合成有序的网络结构;0.7%盐卤形成凝胶的网孔的个数最多,孔径有减小趋势,孔径均等于或小于1μm,其原因为:随着盐卤浓度的进一步增加,正离子对蛋白的静电屏蔽作用增强,使得大豆蛋白分子之间的斥力进一步降低,引力增加,于是蛋白相互结合的速率加快,形成的网孔变多,孔径略有减小。

对于葡萄糖酸内酯制备的凝胶样品来说,随着葡萄糖酸内酯浓度的增加,网孔个数先增后减,0.06 mol/L葡萄糖酸内酯形成凝胶的孔的个数最多,孔径呈减小趋势,其原因为:当加入葡萄糖酸内酯后,葡萄糖酸内酯逐渐水解产生H+,使蛋白质分子所带负电荷减小,分子间的静电斥力减弱,当葡萄糖酸内酯的浓度达到一定程度时,在疏水相互作用等引力的作用下,蛋白分子逐渐结合到一起,形成凝胶网络。GDL浓度高于0.06 mol/L后,葡萄糖酸内酯进一步水解产生H+,大豆蛋白分子电荷量继续减小,分子间的结合力相对来说加强,蛋白分子相互结合的速率加快,容易堆扎在一起,孔的个数就会减少,孔径也变小。

此外,对于应用转谷氨酰胺酶制备的凝胶样品来说,TGase浓度是40 kat/g时,网孔的数量最多,孔径最小。转谷氨酰胺酶(transglutaminase,简称TGase,全称是蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰胺基转移酶)是一种能够催化蛋白质中赖氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上γ-羟酰胺基之间结合反应的酶,蛋白或多肽之间发生共价交联形成共价化合物,其中蛋白质(或多肽)交联所产生的桥叫做ε-(γ-谷氨酰胺基)赖氨酸键(G-L键)[6]。Chanyongvorakul等[7]报道大豆蛋白在TGase的作用下,酸性亚基能够交联而被聚合。Sakamo[8]测定了TGase酶促反应物ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸的含量,证明赖氨酸的含量随着该酶浓度的升高而升高,这和本实验中低酶浓度时的变化一致。TGase浓度升到50 kat/g时,冻干凝胶孔的个数迅速减少,孔径也很小,说明维系蛋白质凝胶网络的稳定所需的共价键的数目具有一定的饱和性,过多的酶量反而不利于凝胶的网络结构。

图1是3种凝固剂处理的凝胶中网孔个数较多的凝胶样品的SEM图,图1a是0.7%盐卤处理的凝胶的SEM图,图1b是0.06 mol/L葡萄糖酸内酯处理的凝胶的SEM图,图1c是40 kat/g转谷氨酰胺酶处理的凝胶的SEM图。

图1 不同凝固剂处理的凝胶的显微结构(均由2.5%戊二醛固定)Fig.1 Microstructure of gels treated by different coagulants(all of gels were fixed by 2.5%glutaraldehyde)

由图1可见,采用2.5%戊二醛固定凝胶结构的条件下,用3种凝固剂制备的大豆蛋白干凝胶的微观结构有很大的差异:盐卤处理凝胶的网络结构较粗疏、网孔大小不均且分布不均(图1a),葡萄糖酸内酯处理的凝胶的网络结构致密程度高、网孔较小且均匀(图1b),转谷氨酰胺酶处理凝胶的网络结构与葡萄糖酸内酯处理凝胶的网络结构相似,但其孔径更小(图1b孔径为 0.3μm,图 1c孔径为 0.1μm)。

2.1.2 固定剂对凝胶显微结构的影响

为了真实反映大豆蛋白凝胶的结构,采用固定剂固定其结构。常用的固定剂有乙醇、冰醋酸、甲醛、戊二醛等,戊二醛是蛋白质的强固定剂,但由于其毒性,故本实验采用了100%乙醇作为固定剂,与戊二醛固定凝胶的结构做对比,以观察乙醇的固定效果。

图2是由0.7%盐卤制备的大豆蛋白凝胶的SEM图。

图2 不同固定剂处理的凝胶的显微结构(凝固剂均为0.7%盐卤)Fig.2 Microstructure of gels treated by different fixatives(coagulant of gels was 0.7%brine)

由图2可见,2.5%和6%戊二醛的固定效果相似,由此判断,不同浓度的戊二醛对凝胶的显微结构无显著影响;100%乙醇同样能够起到很好的固定效果,乙醇是一种极性有机溶剂,羟基中的H带正电,O带负电,可分别与大豆蛋白分子中的相反电荷作用,降低蛋白质分子间的无序凝聚,有利于形成有序的网络结构。

2.2 凝固剂和固定剂对凝胶硬度的影响

凝胶强度是大豆蛋白凝胶的一个很重要的参数,也反映出蛋白网络结构的紧密程度,因此采用凝胶的硬度来反映其强度的大小。图3是盐卤处理的冻干凝胶的硬度。

图3 盐卤和固定剂对凝胶硬度的影响Fig.3 Effect of brine and fixatives on the hardness of the gel

由图3可见,同种固定剂固定的凝胶硬度随着盐卤浓度的增加变化不大,不同的固定剂能对凝胶硬度产生显著影响,100%乙醇固定的凝胶的硬度最大(约2500g),其次是6%戊二醛固定的凝胶硬度(约2000g),2.5%戊二醛固定的凝胶硬度最小(约1500 g)。100%乙醇固定的凝胶硬度最大,分析原因是:乙醇分子通过羟基OH和蛋白分子之间形成氢键,提高了大豆蛋白分子定向排列的有序性,因此用乙醇固定凝胶的硬度有显著的提高。

2.5%和6%的戊二醛对冻干后凝胶的硬度有显著影响,故进一步对中间浓度3.5%、4.5%、5.5%戊二醛处理的葡萄糖酸内酯凝胶的硬度进行检测,观察不同浓度的戊二醛处理的凝胶硬度是否有明显区别。100%乙醇固定的葡萄糖酸内酯凝胶冻干后碎成小块,故无法进行硬度测定。

图4 葡萄糖酸内酯和固定剂对凝胶硬度的影响Fig.4 Effect of GDL and fixatives on the hardness of the gels

由图4可见,葡萄糖酸内酯浓度对凝胶硬度的影响不大,而不同浓度的戊二醛能对凝胶硬度产生明显的影响,硬度随着戊二醛浓度的增加而增大,2.5%戊二醛固定的凝胶硬度最小(约1000 g),6%戊二醛处理的凝胶硬度最大(约3500 g)。

凝胶的显微结构直接影响着其物理特性,大豆蛋白凝胶不同的网络结构导致了强度的变化。网孔越致密,强度越高。由表1分析得知0.06 mol/L葡萄糖酸内酯处理的凝胶具有最致密的网络结构,0.1 mol/L葡萄糖酸内酯处理的凝胶有最少的网孔和最小的孔径,因此0.1mol/L葡萄糖酸内酯处理的凝胶的硬度是最大的。

图5 转谷氨酰胺酶和固定剂对凝胶硬度的影响Fig.5 Effect of TGase and fixatives on the hardness of the gels

图5是转谷氨酰胺酶处理的凝胶的硬度。随着TGase酶量的增加,冻干凝胶的硬度逐渐增加,这说明形成的GL肽键在空间结构上提高了蛋白质凝胶网络的机械性能,有利于凝胶网络结构的稳定。6%戊二醛固定的凝胶硬度明显高于2.5%戊二醛固定的凝胶硬度。

3 结论

通过对不同的凝固剂和固定剂作用下形成大豆蛋白凝胶显微结构和硬度的测试与观察分析,结果表明:大豆蛋白凝胶的网络结构主要是由凝固剂决定的,由0.7%盐卤、0.06 mol/L葡萄糖酸内酯、40 kat/g转谷氨酰胺酶制备的凝胶有较多的网孔个数;大豆蛋白凝胶的硬度与凝固剂和固定剂的浓度有关,其中固定剂对凝胶硬度的影响显著,100%乙醇固定的凝胶的硬度最大,其次是6%戊二醛固定的凝胶的硬度。

以上数据为大豆蛋白凝胶制备的工业化生产提供了理论参考,也为大豆蛋白凝胶在组织工程支架材料方面的应用研究提供了基础的数据。另外,通过研究转谷氨酰胺酶在凝胶形成中的作用机理,发现该酶适合于制备大豆蛋白凝胶,这将是大豆蛋白凝胶方面新的研究方向。

[1]陈复生,李里特.大豆蛋白凝胶光学性质及其应用的研究[D].北京:中国农业大学,2002:3

[2]Cai T D,Chang K C.Dry tofu characteristics affected by soymilk solid content and coagulation time[J].Journal of food quality,1997,20(5):391-400

[3]Beddow C G,Wong J.Optimization of yield and properties of silken tofu from soybean.Coagulant concentration,mixing and filtration pressure[J].International journal of food science and technology,1987,22(1):29-34

[4]刘志胜,李里特.豆腐凝胶的研究[D].北京:中国农业大学,2000:34-45

[5]李里特,刘志胜,辰巳英三.加工条件对豆腐凝胶物性品质的影响[J].食品科学,2000,21(5):26-29

[6]唐传核,杨晓泉,彭志英,等.微生物转谷氨酰胺酶催化大豆11S球蛋白聚合研究[J].食品科学,2002,23(3):42-46

[7]Chanyongvorakul Y,Matsumura Y,Sakamoto H,et al.Gelation of bean 11S globulins by Ca2+-independent transglutaminase[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1994,58(5):864-869

[8]Sakamoto H,Kumazawa Y,Motoki M.Strength of protein gels prepared with microbial transglutaminase as related to reaction conditions[J].Journal of food science,1994,59(4):866-871

猜你喜欢

凝固剂戊二醛谷氨酰胺
高效液相色谱法测定猪心脏瓣膜假体中戊二醛残留量
豆腐凝固剂的研究进展
姜汁在豆腐凝固中的应用研究
豆腐凝固剂的研究进展
离子选择电极法测定谷氨酰胺酶活力研究
精氨酸联合谷氨酰胺肠内营养对烧伤患者的支持作用
凝固剂诱导下豆乳蛋白质的凝固聚集机理及凝固过程
谷氨酰胺在消化道肿瘤患者中的应用进展
谷氨酰胺转氨酶对鱼肉保水性的影响
戊二醛对护士的职业危害及防护对策