携带miR29c重组腺病毒的制备及其促骨髓瘤细胞凋亡作用

张怡堃，王华，杨萍，李泽良，杨月峰，陈协群，王立生

自miRNA 被发现以来，已日益成为分子生物学研究的热点。尽管已经取得了大量令人欣喜的成果，但在miRNA的生物发生、功能行为等众多环节上仍有很多未解之谜[1-2]；这一方面要求我们谨慎地看待和应用已有的研究成果，另一方面要加快完善 miRNA 相关的基础分子生物学机制的研究，寻找和开发更多适用于miRNA 研究的新技术，为全面理解 miRNA的生物学意义奠定更为牢固的基础。

miR29c是我们通过 miRNA 微阵列生物芯片筛选获得的在骨髓瘤细胞中高表达的miRNA，但是对于其在骨髓瘤中的功能研究鲜有报道。为更好研究其功能，我们构建了携带 miR29c的重组腺病毒，并利用流式细胞术检测了其对骨髓瘤细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株、细胞和重组腺病毒 质粒：穿梭质粒 pShuttle-cmv、腺病毒骨架质粒 pAdEasy-1购自美国 Strategene公司；pcDNA3.0-miR29c 质粒由军事医学科学院郑晓飞教授惠赠。

菌种：大肠杆菌 BJ5183 购自美国 Strategene公司、DH5a 感受态细胞购自北京博大泰克生物基因技术责任有限公司。

细胞：人骨髓瘤细胞系 SKO-007和U266（含10% 元亨血清的1640 培养基）、人骨髓瘤细胞系XG7 含 10% 元亨血清，3 ng/ml IL-6的1640 培养基）；HEK293 细胞（Ad5 E1 区转化的人胚肾细胞）为本室保存。

重组腺病毒：重组腺病毒 Ad5F11p-EGFP、Ad5F11p 为本室构建制备。

1.1.2 主要试剂 动物基因组抽提试剂盒MagExtractor-Genome、高保真 DNA 聚合酶 KOD-plus 购自日本 Toyobo公司；离心柱型质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒，脂质体 2000、D2000 marker 购自北京天根生物技术有限公司；限制性内切酶 PacI、PmeI 购自美国 Biolab公司；KpnI、EcoRV、HindIII、XbaI、小牛肠来源的碱性磷酸酶（CIAP）、λ/HindIII Marker 购自日本TaKaRa公司；RPMI 1640、DMEM 培养基购自美国 Sigma公司；FBS 购自美国 Hyclone公司和北京元亨圣马生物技术研究所；其他试剂：胰酶、PBS 按分子克隆配制；琼脂糖购自西班牙 Biowest Agarose Regular公司。

1.1.3 主要仪器 Mastercycler PCR 仪购自德国Eppendorf公司；倒置荧光显微镜和普通显微镜购自日本 Olympus公司；CCL-18 数码成像系统购自日本 Nikon公司；紫外凝胶成像仪购自美国UVP公司；水平电泳系统购自北京六一仪器厂；高速冷冻离心机购自军事医学科学院仪器厂；DU640 型紫外分光光度计购自美国 Beckman公司；2300 型 CO2气体培养箱购自美国 Thermo公司；高速台式离心机购自美国 Heraeus公司。

1.2 方法

1.2.1 携带 miR29c 基因腺病毒载体的构建 以pcDNA3.0-miR29c 为模板设计引物，于两端分别连接酶切位点 KpnI和EcoRV，PCR 扩增获取miR29c 基因。引物：上游：5' gggggTACCgAggATgC CCTggAgTATTC 3'；下游：5' ggggATATCCATgATC TTCCTTCCCTATTC 3'；扩增条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 25 s，50 ℃ 30 s，68 ℃ 20 s，6个循环；94 ℃25 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 20 s，25个循环；68 ℃ 4 min。穿梭质粒 pShuttle-CMV 与miR29c 基因分别进行 KpnI和EcoRV 双酶切后，T4 DNA 连接酶于16 ℃ 连接过夜，转化 DH5α 感受态细胞，Kana+LB 平板筛选 pShuttle-CMV-miR29c。pShuttle-CMV-miR29c 酶切鉴定正确后送北京奥科生物技术有限公司测序。测序鉴定正确的穿梭质粒pShuttle-CMV-miR29c 经 PmeI 酶切后线性化，CIAP 去磷酸化并割胶纯化。纯化产物以 200 Ω，2.5 kV，25 μF的条件，电击转化含有 Ad5F11p 骨架质粒的BJ5183 感受态细胞。Kana+筛选pAd5F11p-miR29c，PacI 酶切鉴定重组质粒。

1.2.2 重组腺病毒 Ad5F11p-miR29c的制备及鉴定 重组腺病毒质粒 pAd5F11p-miR29c 经 PacI酶切后，酚氯仿抽提纯化，紫外分光光度法测定线性化质粒的浓度及纯度。采用脂质体转染方法，将其转染人胚肾细胞 HEK293，10～12 d 观察噬斑形成和细胞病变并收集病毒液。

病毒基因组DNA 提取：将病毒液感染 HEK293细胞后，收集病变细胞，重悬于400 μl PBS 中；–70 ℃和37 ℃ 反复冻融 3 次后，12000 r/m 离心 5 min，收集上清；分别加入 21 μl 10 mg/ml的蛋白酶 K、21 μl 10% SDS 以及9 μl 0.5 mol/L EDTA，于37 ℃ 放置过夜；酚氯仿抽提获取病毒基因组DNA。以病毒基因组DNA 为模板，PCR鉴定目的基因 miR29c的表达。

1.2.3 重组腺病毒 Ad5F11p-miR29c 及对照病毒 Ad5F11p-EGFP的扩增及滴度测定 将鉴定正确的Ad5F11p-miR29c 病毒液以及本室保存的Ad5F11p-EGFP 病毒液感染 HEK293 细胞，获取大量病变细胞，重悬于少量培养上清中；于–70 ℃和37 ℃ 反复冻融 3 次，于4 ℃，3000 r/m 离心30 min，收集病毒上清。经氯化铯密度梯度离心收集病毒带，过夜透析后将纯化的病毒液分装，–70 ℃保存。经快速 CPE 法和有限稀释法[5]分别检测病毒滴度。

1.2.4 重组腺病毒 Ad5F11p-EGFP 对骨髓瘤细胞感染效率检测 重组腺病毒 Ad5F11p-EGFP 分别以 50、100、150、200和250 MOI 分别感染人骨髓瘤细胞系 SKO-007、U266和XG7。荧光显微镜和流式细胞术分别检测细胞感染效率。

1.2.5 miR29c 对骨髓瘤细胞凋亡的影响 选择最佳感染复数，以 Ad5F11p-miR29c 感染骨髓瘤细胞，Annexin-V/PI 双标，经流式细胞术检测细胞凋亡。

2 结果

2.1 成功构建携带 miR29c 基因的腺病毒载体pAd5F11p-miR29c

以 pcDNA3.0-miR29c 质粒为模板进行 PCR扩增，成功获得 miR29c 基因（图 1A）。将 miR29c基因插入到穿梭质粒 pShuttle-CMV，筛选得到pShuttle-CMV-miR29c。酶切鉴定结果显示，KpnI和EcoRV 双酶切出现 250 bp 左右条带，与预期相符；PCR 扩增目的基因 miR29c，结果如图 1B 所示，证实质粒正确。最终经北京奥科生物技术有限公司测序正确。表明已成功构建携带目的基因的穿梭质粒 pShuttle-CMV-miR29c。

经去磷酸化处理的线性化穿梭质粒 pShuttle-CMV-miR29c，电击转化含 Ad5F11p 骨架质粒的BJ5183 感受态细胞，Kana+筛选阳性克隆。PacI 酶切出现 2 条条带，与Ad5F11p-EGFP 质粒的酶切产物一致，表明已成功获得重组腺病毒质粒pAd5F11p-miR29c（图 1C）。

图1 pAd5F11p-miR29c 构建及鉴定Figure1 Construction and identification of pAd5F11pmiR29c

2.2 成功制备重组腺病毒 Ad5F11p-miR29c 并鉴定正确

图2 HEK293 细胞噬斑产生及完全病变（A：细胞噬斑；B：完全病变）Figure2 HEK293 cells with plaque forming and completely cytopathy (A: Plaque forming cells; B: Cells with completely cytopathy)

重组腺病毒质粒 pAd5F11p-miR29c 经 PacI线性化和酚氯仿抽提后，紫外分光光度计测定其OD260/OD280比值为1.892，质粒浓度为655μg/ml，均符合转染条件。转染细胞融合度达到 80% 以上的HEK293 细胞，9 d 出现噬斑，12 d 出现细胞完全病变（CPE）（图 2）。

提取病毒基因组DNA，采用 miR29c 基因的引物进行 PCR 扩增，产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳，条带大小为250 bp 左右，与目的条带一致（图3）。表明已经成功制备重组腺病毒 Ad5F11pmiR29c。

图3 PCR 鉴定病毒基因组中 miR29c 表达电泳结果Figure3 Identification of recombinant adenoviral vectors carrying miR29c with PCR method

表1 流式细胞术检测 Ad5F11p-EGFP 感染 48 h 后各细胞系 EGFP 表达Table1 EGFP expression after infection with Ad5F11p-EGFP in hemapoietic cell lines

2.3 重组腺病毒 Ad5F11p-EGFP 对骨髓瘤细胞感染效率的检测

快速 CPE和有限稀释法检测重组腺病毒Ad5F11p-miR29c和Ad5F11p-EGFP的感染滴度，分别为1.56×1010和1.0×109。Ad5F11p-EGFP分别以 50、100、150、200、250 MOI 感染人骨髓瘤细胞系 SKO-007、U266、XG7和K562。感染后48 h，流式细胞术检测绿色荧光蛋白 EGFP的表达，结果如表1 所示。

2.4 重组腺病毒 Ad5F11p-miR29c 可以介导miR29c 在骨髓瘤细胞中高表达

Ad5F11p-miR29c 以 150 MOI 感染 SKO-007和U266 细胞，以 100 MOI 感染 XG7 细胞。感染后48 h，qRT-PCR 检测 miR29c的表达（图 4）。结果表明，Ad5F11p-miR29c 感染后48 h，骨髓瘤细胞 SKO-007、U266和XG7 细胞中 miR29c的表达率明显高于感染前。表明 Ad5F11p-miR29c能够在造血细胞中有效表达。

图4 Real-time PCR 检测重组腺病毒 Ad5f11p-miR29c感染骨髓瘤细胞系 48h 后，miR29c 表达量的变化Figure4 Determination of miR29c levels in SKO-007，U266 and XG-7 cells 48 h after infection with Ad5F11p-miR29c by qRT PCR

2.5 过表达 miR29c 诱导骨髓瘤细胞的凋亡

用腺病毒 Ad5F11p-miR29c 以优化后的感染复数 150 MOI 感染 SKO-007 细胞，100 MOI 感染 XG7 细胞，同时以未感染及以 Ad5F11p-null空病毒感染的细胞为对照，于感染后12、24、48 h，Annexin-V/PI 双标后经流式细胞术检测细胞凋亡率。结果如图 5、图 6 所示，Ad5F11p- miR29c 感染后48 h，骨髓瘤细胞 SKO-007和XG7 细胞的凋亡率明显高于感染前（未感染病毒的细胞凋亡率分别为SKO-0078.99%，XG75.62%；感染空病毒的细胞凋亡率分别为SKO-00711.2%，XG713.44%，而感染 Ad5F11p-miR29c 病毒的细胞凋亡率分别达到 SK0-00726.5%，XG746.9%）。表明过表达 miR29c 可诱导骨髓瘤细胞的凋亡。

图5 Ad5F11p-miR29c 病毒感染 SKO-007（A）和XG7（B）细胞 12、24、48 h 后的流式检测 Annexin V/PI 表达，同时以未感染病毒的细胞和用空病毒感染的细胞设为对照，为三次独立的实验结果的统计分析，采用 t 检验分析Figure5 Annexin V/PI assay in SKO-007 (A) and XG7 (B)cells after 12, 24 and 48 h infection with adenovirus miR-29c or controls (without infection or empty vector).The results are shown as percentage of apoptotic cells.Data are the average of three independent experiments±SD.P-values were obtained using t tests.

图6 miR29c 诱导 SKO-007 细胞凋亡的代表性的流式图Figure6 Flow cytometric analysis of apoptosis with Annexin V/PI staining in SKO-007cells

3 讨论

miRNA是近年来发现的一种内源性非蛋白质编码的约 22个核苷酸左右的单链小 RNA，具有高度的种间保守性和时空特异性。通过作用于靶基因的3′UTR（3′ 非翻译区）在转录后水平调节靶基因的表达，广泛地参与调节细胞增殖、分化、分泌和凋亡等生命活动[6]。miRNA的这些特点，为生物治疗开拓了新的视野。通过基因疗法手段控制miRNA 水平从而治疗疾病就成为治疗学进展中极具吸引力的一项新方法。

众所周知，miRNA 参与人类多种疾病的形成过程，这就为疾病治疗提供了新的潜在靶标。一直以来人们都在尝试研究如何在体内特异地调节miRNA的水平。这么多年来在反义RNA、核酶以及一些基因治疗方法上取得的研究成果为体内研究 miRNA 提供了一个良好的技术平台和研究思路，但均各自存在缺陷和不足[7-9]。目前，利用miRNA 为基础的生物治疗的主要障碍就是如何有效地将 miRNA 或反义寡核苷酸 anti-miRNA 在体内导入靶细胞。因此，寻找有效的基因转移载体成为众多科研人员的研究重点。

理想的基因转移载体不仅应具有将目的基因转移到靶细胞的功能，还应该保证目的基因按时按量表达。重组腺病毒构建载体是目前应用最多的一种高效基因转移载体[2-3]，宿主细胞范围广、插入外源基因稳定、目的基因表达水平高、包装容量大及不整合等优点；腺病毒载体构建、制备简单，容易制备高滴度病毒颗粒。我们前期已经利用纤维顶球替代改构方法构建了具有造血细胞靶向性的腺病毒载体系统 Ad5F11p，该系统方便构建带有不同功能基因的靶向腺病毒载体，大大地提高对造血细胞的感染效率，因而 Ad5F11p 为造血调控的基础研究以及血液肿瘤的基因治疗奠定基础，是非常有用的腺病毒载体[3-4]。

本实验选用血液细胞靶向性腺病毒 Ad5F11p作为载体，首先通过 PCR 方法获得目的基因并在其两端分别连接上酶切位点，随后将目的基因miR29c 插入穿梭质粒的多克隆位点，通过酶切、PCR 扩增及测序三重鉴定，证实目的基因 miR29c已正确插入穿梭质粒 pShuttle-CMV 中。与含腺病毒 Ad5F11p 基因组的质粒 pAd5F11p 共转染至BJ5183 细胞内进行同源重组，重组后转染 HEK293细胞制备病毒，有重组病毒生成后形成的空斑大多为含有目的基因的阳性克隆。本实验中，感染性试验证明了腺病毒载体具有良好的感染活性。采用插入的miR29c 基因特异引物和腺病毒载体特异引物进行 PCR 鉴定，证明包装的腺病毒基因组携带miR29c。利用带有 GFP 对照基因的腺病毒载体Ad5F11p-GFP，初步检测了其对 3 种骨髓瘤细胞系的感染效率，感染滴度在100～150 MOI 范围内，感染效率均在90% 以上，体现了很好的造血细胞靶向性。用重组腺病毒感染 SKO-007等细胞后，通过 real-time PCR 证实腺病毒载体可以提高miR29c 在骨髓瘤细胞中的表达。利用腺病毒载体在骨髓瘤细胞中过表达 miR29c，发现过表达miR29c 可诱导骨髓瘤细胞的凋亡。本研究通过构建并制备携带 miR29c 目的基因的腺病毒，初步观察了其对造血细胞的感染及对骨髓瘤细胞凋亡的影响，为进一步 miRNA 功能研究及基于miRNA的基因治疗研究打下了基础。

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