蛋白多肽类药物聚乙二醇化修饰研究进展

杨 旭 贡济宇

长春中医药大学药学院，吉林长春 130000

蛋白多肽类药物聚乙二醇化修饰研究进展

杨 旭 贡济宇▲

长春中医药大学药学院，吉林长春 130000

近年来，越来越多具有生物活性的蛋白多肽类药物被发现，因其生理功能上的高效性及专一性而广泛用于治疗各种疾病。但由于其在体内易被降解，且生物半衰期短，使其应用受到了限制。通过化学修饰的方法，可以延长蛋白肽类药物的生物半衰期，提高药效，降低副作用。聚乙二醇能有效增加蛋白多肽类药物在体内的稳定性，本文就聚乙二醇共价连接修饰蛋白质及多肽类药物做一综述。

蛋白质；多肽；聚乙二醇化；研究进展

随着基因工程、生物制药及肽类药物固相合成技术的发展，许多极具开发和应用前景的多肽蛋白类药物逐渐受到关注，且在疾病的诊断、预防及治疗中占有越来越重要的位置。但这类药物稳定性差，在生物体内半衰期较短，所以提高其在体内的稳定性成为研究焦点。聚乙二醇（PEG）是中性、无毒、无免疫原性、有良好的生物相容性的高分子聚合物，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，当耦联到药物分子表面时，可改变其生物分配行为和溶解性，产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中被快速消除。将蛋白肽类药物进行PEG修饰，可以提高药物在体内的稳定性，以改善体内半衰期，因而被广泛用于蛋白多肽药物的修饰，以改善该类药物在体内的性质。本文对PEG的性质、修饰策略及研究现状等方面进行综述。

1 聚乙二醇的性质及选择

PEG是经环氧乙烷聚合生成的一类高分子化合物。它不仅具有良好的水溶性，也能溶于二氯甲烷、乙腈和乙醇等有机溶剂。通过化学反应先在PEG上连接“小分子臂”，再通过连接臂与化合物相接，这一过程称为PEG的活化，活化后的PEG即为PEG修饰剂。本文总结了近年来新兴的几种聚乙二醇修饰剂，见表1。

PEG修饰剂的选择决定了修饰后药物的性质，一个理想的PEG修饰剂至少满足以下条件：（1）无毒，无免疫原性且生化性质稳定。（2）一端有耦联反应活性基团，另一端则被封闭，以避免药物分子之间交叉耦联。（3）选择具体位点PEG化，以确保得到保持最大活性的高重复性产品。（4）尽量使用分支型PEG。（5）PEG分子量的选择要综合考虑生物活性和药代动力学两方面的因素。目前普遍采用分子量大于2万的PEG作为修饰剂。

表1 新型聚乙二醇修饰剂

2 蛋白多肽类药物的聚乙二醇修饰策略

蛋白多肽的PEG化通常以其分子中的氨基、羧基和巯基等官能团为活性位点选择相应类型的PEG进行修饰。蛋白多肽在PEG修饰时要根据蛋白质的构效关系，选择不与受体结合的残基作为修饰位点，以保证修饰后的生物活性。下面根据不同的修饰位点分别介绍几种常见的PEG修饰方法。

2.1 氨基修饰

氨基修饰是最为常用的PEG修饰方法，早期PEG修饰主要针对α或ε的氨基[1]，典型代表有琥珀酰亚胺碳酸酯PEG、苯并三唑碳酸酯PEG等。这类修饰剂反应所需要条件较为温和，对药物稳定性影响相对较小。但其反应选择性低、副产物多、键结合不稳定且PEG自身杂质的干扰较为严重，因而逐渐被新一代PEG所替代。

新一代PEG的类型和种类更加多样化，修饰目标更为明确。其典型代表是丙醛-mPEG。Kinstler OB等[2]研究发现，醛基和伯胺通过Schiff碱，形成一个稳定的伯胺，在pH值约为5时，N末端的α氨基与醛基有很高的选择性。

2.2 巯基修饰

蛋白质上的巯基对PEG呈现高度的选择性，典型代表有马来酰亚胺聚乙二醇、乙烯磺酸聚乙二醇等。这种方法的优点是使PEG连接在蛋白质特定的位置，最低程度减少生物活性；缺点是游离的巯基会增加二硫键杂质和蛋白质二聚体的可能性。

2.3 糖基或N末端修饰

糖基或N末端的丝氨酸或苏氨酸是PEG定点修饰蛋白多肽的另一方法。糖基可被酶或高碘酸钠氧化，形成多种活性的醛基，与聚乙二醇-肼或氨生成可逆的Schiff碱[3]。此法可产生多个成键位点，但只对糖有选择性。蛋白质中丝氨酸或苏氨酸的N末端也可采取定点修饰，可被高碘酸氧化成乙醛酸衍生物。Gaertner HF等[4]用此方法成功地将白介素-8的N末端丝氨酸成功耦联上PEG。

2.4 可逆性修饰

PEG化的目的多数是在蛋白上形成一个稳定的连接键，利于耦联物长期保存和纯化等。但人们注意到，PEG与蛋白形成的稳定的连接键有时会占据或屏蔽蛋白质的活性位点而降低其活性。可逆性修饰可以在不改变活性的情况下增加药物的半衰期。Enzon公司在酸性条件下将PEG-SC和干扰素α-2b耦联[5]，使PEG聚集到His34上，而进入体内后的一段时间，PEG就从蛋白质上缓慢释放，从而保证了药物的生物活性。

PEG修饰反应需要有高度的特异性和温和的反应条件，因此，要针对不同药物的性质选择合适的PEG修饰剂。而对某个药物的修饰方法目前尚没有成形的规律可循，仍需要研发人员根据实际情况逐步摸索完善。

3 PEG修饰技术的研究现状

目前的PEG修饰技术均为药物与PEG的共价结合，这可能会造成药物的聚集，体内活性全部或部分失活。近年来新开发的非共价结合技术可有效地解决上述问题。这种技术是基于PEG衍生物的疏水基团与蛋白质疏水表面间的疏水相互作用，使PEG形成的空间位阻能够屏蔽蛋白质间的相互作用，而减少聚集现象[6-8]。Mueller C等[9]利用色氨酸作为疏水基团与mPEG结合，再用于修饰降钙素，所得产物与丹磺酰-PEG化降钙素相比，在较恶劣的条件下能更好地抑制PEG化降钙素的聚集。

PEG修饰技术不仅应用于蛋白多肽类药物，近几年在纳米医药领域也有应用。PEG修饰的纳米粒可避免被单核巨噬细胞吞噬系统（MPS）识别，进而影响其体内的生物分布，并延长在血中的循环时间。目前，PEG化壳聚糖纳米颗粒及PEG化脂质体等给药系统均有良好的效果[10-11]。

近年来，随着对PEG化蛋白多肽类药物的不断深入研究，许多蛋白多肽类药物的PEG修饰已卓有成效。诸多国际知名的制药公司已经或正在积极推进蛋白药物的PEG修饰，自1991年第一种用PEG修饰的蛋白药物PEG-ADA被美国FDA批准上市后，近几年上市的PEG修饰的药物也层出不穷[12]。如PEG化干扰素，这种新型干扰素制剂每周只需注射1次，而普通干扰素注射剂的药效仅能维持24 h，用于治疗包括乙型肝炎在内的各种病毒性感染疾病。目前，国内的PEG修饰技术也正在蓬勃发展。由石药集团生产的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子注射液 （商品名为津优力）已于2012年3月17日获得国家食品药品监督管理局批准上市，成为我国第首个上市的PEG修饰药物。该药采用特有的定点修饰技术，将20 KD的PEG分子选择性地与rhG-CSF蛋白质N末端定点交联而成，所得到的产物具备明确而单一的结构。PEG分子没有毒性和免疫原性，并可被机体安全清除，而rhG-CSF经PEG修饰后，其血浆半衰期延长（达47 h）、免疫原性降低、生物利用度提高、稳定性增强、安全性更高。近些年来，由于国内许多制药公司对PEG修饰技术不断的深入研究，现已有十多种PEG修饰药物审报临床审批（表2），相信在不久的将来，将有更多的PEG药物问市。

随着PEG化学的高速发展以及许多PEG衍生化试剂的商品化、PEG化药物的陆续上市，可以预测药物的PEG修饰研究将得到越来越广泛和深入的重视，特别在提高蛋白、多肽药物的稳定性、延长半衰期，降低抗肿瘤药、抗真菌药、抗生素、免疫抑制剂的毒副作用和提高这些药物的靶向性，PEG修饰更具有持续的魅力和非常广阔的前景。

表2 国内PEG修饰药物研究现状

[1]姜忠义，许松伟，高蓉.生物分子化学修饰用聚乙二醇衍生物的合成及应用[J].高分子通报，2002，（1）：34-40.

[2]KinstlerOB，BremsDN，LaurenSL，etal.Characterizationandstabilityof N-terminally PEGylated rhG-CSF[J].Pharm Res，1996，13（7）：996-1002.

[3]Harris J，Zalipsky S.Poly（ethyleneglycol） Chemistry and Biological Applications[M].Washington DC：ACS Books，1997：347-381.

[4]Gaertner HF，Offord RE.Site-specific attachment of functionalized poly（ethylene glycol） to the amino terminus of proteins[J].Bioconjug Chem，1996，7（1）：38-44.

[5]Kozlowski A，Harris JM.Improvements in protein PEGylation：pegylated interferons for treatment of hepatitis C[J].Control Release，2001，72（1）：217-224.

[6]Siato A，Myiauchi E.Stabilized protein-containing formulations：USA，20090264629[P].2011-05-05.

[7]Rodrigu-Martínez JA，Rivera-Rivera I.Prevention of benzyl alcohol-induced aggregation of chymotrypsinogen by PEGylation[J].J Pharm Pharmacol，2011，63（6）：800-805.

[8]惠希武，陈虹.蛋白质、多肽类药物聚乙二醇修饰的研究进展[J].中国生物制品学杂志，2012，25（4）：520-524.

[9]Mueller C，Capelle MA.Tryptophan-mPEGs：novel excipients that stabilize salmon calcitonin against aggregation by non-covalent PEGylation[J].Eur J Pharm Biopharm，2011，79（3）：646-657.

[10]Kang EY，Moon HJ，Joo MK，et al.Thermogelling chitosan-g-（PAFPEG）aqueous solution as an injectable scaffold[J].Biomacromolecules，2012，13（6）：1750-1757.

[11]Knudsen NO，Ronholt S，Satle RD，et al.Calcipotriol delivery into the skin with PEGylated liposomes[J].Eur J Pharm Biopharm，2012，81（3）：532-539.

[12]Ryan SM，Mantovani G，Wang X，et al.Advances in PEGylation of important biotech molecules：delivery aspects[J].Expert Opin Drug Deliv，2008，5（4）：371-383.

Research progress on PEGylation of protein and peptide drugs

YANG Xu GONG Jiyu▲
College of Pharmacy,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130000,China

More and more protein and peptide drugs are discovered in recent years.It is used for treating numerous diseases because of its high efficiency and specificity.In fact,its application has been limited because of the short half-life.The method of chemical modification is useful to prolong the half-life,it can improve activity and reduce side effect.The PEGylation can effectively increase the protein peptide drugs in vivo stability.This paper discusses some methods of chemical modification of proteins and peptides by PEG conjugation.

Protein;Peptide;PEGylation;Research progress

R914

A

1674-4721（2012）11（a）-0016-03

杨旭（1984-），男，硕士研究生；研究方向：蛋白肽类药物合成。

▲通讯作者

2012-06-25 本文编辑：陈 俊）