不同质量浓度的黄芪总黄酮对高糖培养下牛视网膜血管周细胞DNA损伤的影响

江 红 匡洪宇 刘 余 马丽丽 康英英

（哈尔滨医科大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150000）

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常见的严重微血管并发症，可导致失明。DR的发病机制尚不明确，最近研究表明高血糖导致的DNA氧化损伤是DR发病机制的中心环节，阻断这一环节可以阻断DR发生的其他病理进程［1］。黄芪总黄酮是黄芪有效部位的提取物，是黄芪中清除自由基的主要活性成分，具有明显的抗氧化和自由基清除活性。本实验通过研究不同质量浓度黄芪总黄酮培养的牛视网膜微血管周细胞DNA损伤情况，探讨其对牛视网膜微血管周细胞DNA损伤的影响，为黄芪治疗DR的临床研究及应用提供资料。

1 材料与方法

1.1 药物 取黄芪10 kg，以95%乙醇减压回流提取3次，合并，浓缩至浸膏，取浸膏加蒸馏水溶解，用醋酸乙酯萃取数次，合并萃取液，浓缩，过柱，得总黄酮。提取物由黑龙江中医药大学药理学实验室鉴定。用前以磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至所需质量浓度。

1.2 试剂及仪器 DMEM培养基（低糖，美国Hyclone公司），优级胎牛血清（天津灏洋生物公司），胶原酶Ⅱ型（美国Invitrogen公司），双抗（大连美罗大药厂），胰酶、多聚赖氨酸、单克隆抗体及免疫组化试剂盒（武汉博士德生物公司）、低熔点琼脂糖（德国Merck-Darmstadt公司）、荧光显微镜、DYY-32型电泳仪以及细胞培养相关材料。

1.3 视网膜毛细血管周细胞的原代培养及鉴定 采用的培养方法参照Li等［2］的实验。分离胎牛眼视网膜，匀浆，0.2%胶原酶37℃消化40 min，200目筛网过滤，滤心，加入含20%胎牛血清DMEM培养液，接种入50 cm培养瓶中，在37℃含5%CO2及90%湿度培养箱中培养。倒置相差显微镜观察细胞生长形态，再去除培养液，烤干后采用鼠抗α平滑肌肌动蛋白抗体及兔抗神经胶质纤维酸性蛋白抗体，进行视网膜血管周细胞免疫组化鉴定。

1.4 分组与处理 取体外培养3代融合的周细胞，用培养液配成单个细胞悬液，调整细胞密度为1×107/L，接种于96孔培养板内。细胞贴壁后更换不同浓度的葡萄糖培养液，对照组加入含20%血清的低糖 DMEM（5.5 mmol/L），模型组为高糖组（25 mmol/L），干预组为在模型组中加入不同质量浓度的黄芪总黄酮1、2、3、4组（0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL），孵育 6 d。

1.5 彗星试验 参照Hockemeyer［3］的方法改良。制备0.5%的正常熔点琼脂糖和0.5%的低熔点琼脂糖。取细胞悬液与0.5%低熔点琼脂糖混匀后加到预处理过的磨砂玻片上，经细胞裂解和DNA解旋后于4℃、25 V、300 mA条件下电泳25 min；经过中和、EB染色、低温避光，最后在荧光显微镜下计数拖尾细胞百分数（彗星率）并测量拖尾细胞尾长。每个样本随机测量100个彗星细胞的尾长和300个细胞中彗星样细胞的数目

1.6 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件。计量资料以（）表示，采用单因素方差分析及直线相关回归分析方法统计数据资料。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞鉴定 倒置相差显微镜下观察，原代培养的BRPs 1～2 d后贴壁，贴壁后逐渐伸展，呈不规则多角形，胞体不大，可见突起，生长较快，1～2周BRPs可达到融合，细胞密集，无接触性抑制。α平滑肌肌动蛋白抗体染色显示BRPs胞浆内呈特异性棕黄色着色，阳性率达99%以上，兔抗神经胶质纤维酸性蛋白抗体免疫组织化学染色BRPs胞浆不着色。

2.2 各组周细胞DNA损伤比较 见表1。与高糖组相比，黄芪总黄酮各组周细胞彗尾长度及彗星率降低，具有统计学意义（P＜0.01），并随着质量浓度的增加，周细胞彗尾长度及彗星率降低呈现一定的剂量-效应关系，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨 论

视网膜组织是眼睛的多层感觉组织，富含多不饱和脂肪酸，它对ROS和脂质过氧化物特别敏感。自由基活性增强和抗氧化能力降低是DR发生的重要机制。已有临床研究证实以黄芪为主要成分的中药颗粒对保护周细胞、防止周细胞消失及基底膜增厚有较好疗效。实验表明黄芪总黄酮可降低细胞脂质过氧化物的生成，直接清除羟自由基和超氧阴离子自由基，对DNA损伤有明显的保护作用。而最近研究发现黄芪总黄酮具有抗突变、抗肿瘤和抑制动脉粥样硬化等多种生物学效应［4］。

表1 各组彗尾长度与彗星率比较（）

表1 各组彗尾长度与彗星率比较（）

与对照组比较，*P＜0.01；与高糖组比较，△P＜0.01；与黄芪总黄酮1组比较，▲P＜0.01；与黄芪总黄酮2组比较，#P＜0.01；与黄芪总黄酮3组比较，○P＜0.01。

组别 n 彗尾长度 彗星率（%）对照组 7 6.15±0.63 7.77高糖组 7 23.70±4.775* 47.77*黄芪总黄酮1组 7 19.11±1.51* 36.23*黄芪总黄酮 2组 7 17.74±2.56*△▲ 24.32*△▲黄芪总黄酮 3 组 7 14.40±3.3*△▲# 16.04*△▲#黄芪总黄酮 4 组 7 10.54±2.34*△▲#○ 13.56*△▲#○

本研究结果显示一定质量浓度的黄芪总黄酮对高糖培养下的牛视网膜微血管周细胞DNA损伤有明显的抑制作用，且随着质量浓度的增加，周细胞的DNA损伤降低。提示黄芪总黄酮对视网膜血管周细胞有一定保护作用，是一种很有前途的临床抗氧化剂。研究证实抗氧化剂的应用不仅能抑制氧自由基诱导的细胞凋亡，而且能防止糖尿病微血管并发症的发生。徐寒松等［5］研究显示以黄芪为主要成分的通脉糖眼明胶囊能够改善视网膜微循环，对于DR具较好疗效。本研究证实，一定质量浓度的黄芪总黄酮能够抑制牛视网膜微血管周细胞氧化损伤，为临床应用黄芪总黄酮治疗DR提供了理论依据。（第一作者现在黑龙江省医院工作）

［1］Johansen JS，Harris AK，Rychly DJ，et al.Oxidative stress and the use of antioxidants in diabetes：linking basic science to clinical practice［J］.Cardiovasc Diabetol，2005，4（1）：5.

［2］Li AF，Sato T，Haimovici R，et al.High glucose alters connexin 43 expression and gap unction intercellular communication activity in retinalpericytes［J］.InvestOphthalmolVisSci，2003，44（12）：5376-5382.

［3］Hockemeyer D，Sfeir AJ，Shay JW，et al.POT1 protects telomeres from a transient DNA damage response and determines how human chromosomes end［J］.EMBOJ，2005，24（14）：2667-2678.

［4］刘汉丹，瞿佐发.黄芪的药理作用研究进展［J］.现代中西医结合杂志，2002，11（18）：1861-1862.

［5］徐寒松，孔德明，李雪梅，等.通脉糖眼明胶囊治疗单纯型糖尿病性视网膜病变临床研究［J］.中华中医药杂志，2006，21（9）：567-569.