2种消旋卡多曲制剂的人体生物等效性研究

栗 艳，周 伦，杨 静，贾艳艳，宋 薇，冯智军，鹿成韬，陈敏纯，文爱东

（第四军医大学第一附属医院药剂科，西安 710032）

2种消旋卡多曲制剂的人体生物等效性研究

栗 艳＊，周 伦，杨 静，贾艳艳，宋 薇，冯智军，鹿成韬，陈敏纯，文爱东#

（第四军医大学第一附属医院药剂科，西安 710032）

目的：研究消旋卡多曲散剂与消旋卡多曲颗粒的生物等效性。方法：20名健康男性志愿者随机交叉单剂量口服消旋卡多曲散剂（受试制剂）或消旋卡多曲颗粒（参比制剂）200 mg后，采用液-质联用法测定血药浓度，以DAS2.0软件计算药动学参数，并评价其生物等效性。结果：受试者单剂量口服200 mg消旋卡多曲受试制剂或参比制剂后，药动学参数分别为：cmax（286.54±66.14）、（283.73±65.49）ng·mL－1，tmax（1.78±0.48）、（1.68±0.79）h，t1/2（4.02±1.26）、（4.00±1.11）h，AUC0～24h（1 353±431）、（1 293±320）ng·h·mL－1。经方差分析、双单侧t检验及1－2α置信区间法统计分析，各药动学参数差异无统计学意义（P＞0.05）。受试制剂中消旋卡多曲的cmax、AUC0～24h、AUC0～∞的90%置信区间分别为92.2%～111.1%、98.1%～107.7%、98.6%～108.3%。结论：消旋卡多曲散剂与消旋卡多曲颗粒在人体内生物等效。

消旋卡多曲；液-质联用；生物等效性；药动学

消旋卡多曲在体内被迅速水解成活性代谢产物Thiorphan（TP）[1]，该活性产物是脑啡肽酶的选择性抑制剂，从而保护内源性脑啡肽免受降解，增强其生理活性并产生抗分泌作用。临床上消旋卡多曲连同口服补液一起，用于婴儿急性腹泻的对症治疗[2]。本试验旨在通过液-质联用（LC-MS）法测定人血浆中消旋卡多曲的浓度，评价Laboratoire Bioprojet Pharma研制的消旋卡多曲散剂在健康受试者的药动学特征及其与四川百利药业有限责任公司生产的消旋卡多曲颗粒是否等效，为临床治疗的有效性和安全性提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1200液相色谱仪，含真空脱气机、二元泵、自动进样器、柱温箱（美国Agilent公司）；6410三重四级杆串联质谱仪（美国Agilent公司）；MassHunter工作站（美国Agilent公司）；TDL80-2B低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW-80A涡旋混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；TGL-16C高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；电子天平（瑞士Sartorius公司）。

1.2 试药

受试制剂：消旋卡多曲散剂（法国Laboratoire Bioprojet Pharma公司研制，委托北京信成博达科技有限公司，作生物等效性研究，规格：10 mg，批号：SXN137）；参比制剂：消旋卡多曲颗粒（杜拉宝，四川百利药业有限责任公司，规格：10 mg，批号：080601）；消旋卡多曲对照品（Laboratoire Bioprojet Pharma，纯度：99.06%，批号：DD2102.053）；TP对照品（法国Laboratorie Bioprojet Pharma公司，纯度：99.06%，批号：DD2102.053）；内标：洛索洛芬钠对照品（中国食品药品检定研究院，纯度：100.0%，批号：100638-200401）；甲醇为色谱纯，甲酸、乙酸乙酯及L-半胱氨酸均为分析纯；所有试验用水均为双重蒸馏水；空白血浆由第四军医大学第一附属医院提供。

2 方法[3]与结果

2.1 色谱及质谱条件

色谱柱：Dikma Diamonsil（150 mm×2.1 mm，5μm）；流动相：甲醇-0.1%甲醇水溶液（75∶25）；流速：0.25 mL·min－1；进样量：2µL；柱温：35℃。

电喷雾电离源（ESI），负离子模式下以多反应监测（MRM）方式进行监测：TP：m/z 252.1→218.1，碰撞能量：5 eV；内标洛索洛芬钠：m/z 245.1→83.0，碰撞能量：10 eV；毛细管电压：4.0 kV；裂解电压：－70 V；驻留时间：200 ms；雾化气温度：350℃；雾化气流速：10.5 L·min－1；雾化气压力：50 psi。

2.2 标准溶液的配制

2.2.1 TP标准溶液：准确称取TP对照品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入适量甲醇使之溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1 g·L－1的TP贮备液。精密量取TP贮备液1 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得100 mg·L－1的TP甲醇溶液。依次稀释，配制成浓度为10.0、1.00 mg·L－1及100µg·L－1的TP甲醇溶液。

2.2.2 内标溶液：准确称取洛索洛芬钠对照品10.0 mg，置于浓度为100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得100 mg·L－1的内标贮备液。取一定量贮备液稀释，配制成浓度为2 mg·L－1的内标溶液。

2.3 血浆样品的处理

取含药血浆1 mL（已加入10 g·mL－1L-半胱氨酸水溶液100µL），置于10 mL的尖底玻璃离心管中，加入2 mg·mL－1内标溶液40µL及10%冰醋酸水溶液50µL，涡旋30 s；加入乙酸乙酯5 mL，涡旋振荡3 min，4 000 r·min－1离心10 min，取有机层置于另一离心管中，加入10 g·mL－1L-半胱氨酸水溶液50µL，混匀；于30℃水浴中以氮气流吹干，残渣以流动相200µL溶解后于16 000 r·min－1离心5 min，吸取上清液转移至自动进样器样品管中，吸取2µL进样分析。

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线的制备及定量下限考察：取离心管数支，分别精密加入不同量的TP标准溶液，吹干后加入空白血浆1 mL，旋涡30 s混匀，配制成相当于血浆TP质量浓度为3.144、10.48、31.44、104.8、209.6、419.2、1 048 ng·mL－1的含药血浆，按“2.3”项下方法操作，记录色谱图。以待测物浓度（c）为横坐标，待测物与内标的峰面积平均比值（f）为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，得到的直线回归方程即为f＝0.009 346+0.009 168×c（r＝0.999 0）。结果表明，TP在血药浓度3.144～1 048 ng·mL－1范围内线性关系良好。按上述条件测得TP在血浆中的定量下限为3.144 ng·mL－1。

2.4.2 专属性：在本试验所采用的色谱及质谱条件下，TP的保留时间在1.4 min左右，内标的保留时间在1.7 min左右。TP和内标峰形良好，且空白血浆中的内源性物质不干扰TP和内标的测定（见图1）。结果表明本方法具有较高的选择性，能准确测定血浆中TP的浓度，灵敏度较高。

2.4.3 精密度及准确度考察：取离心管数支，精密加入不同量的TP标准溶液，吹干后加入空白血浆1 mL，涡旋30 s混匀，配制成低、中、高（5.24、52.4、524 ng·mL－1）3种浓度的TP标准含药血浆，每个浓度各做5份样品，按“2.3”项下方法操作。依上述方法，连续3 d，并随行一条标准曲线，共3批，记录色谱图。计算TP峰面积（As）和内标峰面积（Ai）的比值f，代入随行标准曲线方程求得样品的实测浓度，考察日内和日间精密度。将f代入随行标准曲线方程，计算所得浓度和加入浓度的比值即为准确度（方法回收率），结果详见表1。

图1 典型图谱A.空白血浆；B.TP最低定量限；C.空白血浆+TP标准溶液+内标溶液；D.受试者口服消旋卡多曲后的血浆样品；1.TP；2.洛索洛芬钠Fig 1 Typical chromatogramsA.blank plasma；B.the LLOQ of TP；C.blank plasma spiked with TP and IS；D.plasma sample after oral dose of racecadotril；1.TP；2.loxoprofen sodium

表1 精密度及回收率试验结果（n＝5）Tab 1 Results of precision and accuracy tests（n＝5）

2.4.4 提取回收率试验：取按“2.4.3”项下方法制备的低、中、高（5.24、52.4、524 ng·mL－1）3种浓度的TP标准含药血浆，每个浓度进行5样本分析。以提取后测得的浓度与未经提取直接测得的浓度之比，考察样品的提取回收率。结果表明，TP在低、中、高3种浓度下样品的提取回收率分别为（68.13±2.89）%、（75.27±3.70）%和（72.91±2.35）%。

2.4.5 样品稳定性考察：本试验考察了TP血浆室温24 h稳定性，反复冻融3次稳定性、长期（30 d）冻存稳定性及预处理后6 h的稳定性。结果表明，TP血浆在上述条件下测定的RSD均＜10%，表明TP血浆稳定性良好。

2.5 受试者的选择

20名男性健康受试者，体重58.0～67.0 kg，年龄30～39岁，经医疗史、心电图、血压、血尿常规及肝肾功能检查，确定为健康状况良好。受试者在研究前7周内未服用其他药物。在被告知所有与药物有关不良反应后，各受试者签署知情同意书；如在试验期间出现严重不良反应或疾病需要接受治疗或要求退出试验者，可终止试验。

2.6 试验方案

采用标准二阶段交叉设计（Two-period crossover design）自身对照试验方法，将20例受试者随机分为A、R组，试验第1阶段A组受试者单剂量口服受试制剂消旋卡多曲散剂200 mg，R组单剂量口服参比制剂消旋卡多曲颗粒200 mg。经1周清洗期后，2组交换服药品种进行第2阶段试验。试验过程中有医疗监护及急救条件，试验组成员有临床主治医师、护师及药师参加。试验期间禁止剧烈活动，禁止吸烟、饮酒或含药物、酒精的饮料等。每次试验前一天19：00后即禁食，早晨空腹给药，用250 mL温开水冲服，服药2 h后方可再饮水，服药后4 h进统一食谱的标准餐。服药前0 h及服药后20、30、40 min及1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、18.0、24.0 h时，由静脉采血5 mL，置肝素化离心试管中（所有采血管在采血前加入L-半胱氨酸150µL作为抗氧化剂[3]），－20℃保存待测。本试验方案已通过第四军医大学第一附属医院伦理委员会批准。

2.7 统计学方法

对2种制剂的AUC、cmax、tmax进行方差分析、双单侧t检验，以1－2α置信区间法进行统计分析，判断生物等效性。

2.8 药-时曲线

20名受试者单剂量口服受试制剂或参比制剂200 mg后，平均药-时曲线见图2。

图2 20名受试者单剂量口服受试制剂或参比制剂200 mg后的平均药-时曲线Fig 2 Mean concentration-time curves of racecadotril in 20 healthy volunteers after a single oral administration of 200 mg test preparation or referencepreparation

2.9 药动学参数及生物利用度

利用药动学软件DAS2.1.1，计算主要药动学参数和生物等效性。cmax、tmax以实测值计算，AUC按梯形面积法计算。有关药动学参数见表2。

表2 20名受试者单剂量口服受试制剂或参比制剂200 mg后的主要药动学参数Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of racecadotril in 20 healthy volunteers after a single oral administration of 200 mg test preparation and referencepreparation

2.10 生物等效性评价

以四川百利药业有限责任公司生产的消旋卡多曲颗粒为参比制剂，估算法国Laboratoire Bioprojet Pharma公司研制的消旋卡多曲散剂相对生物利用度为（103.4±11.8）%。将受试制剂与参比制剂的消旋卡多曲药动学参数cmax、AUC0～24h、AUC0～∞经对数转换后，进行方差分析，并采用双向单侧t检验和1－2α置信区间法进行生物等效性评价，结果表明，消旋卡多曲的cmax、AUC0～24h、AUC0～∞在两制剂间均无显著性差异，均拒绝生物不等效假设。受试制剂的cmax、AUC0～24h、AUC0～∞的90%置信区间分别为92.2%～111.1%、98.1%～107.7%、98.6%～108.3%；tmax经非参数法检验无显著性差异（P＞0.05）。根据以上结果判定受试制剂与参比制剂生物等效。

3 讨论

本试验所建立的测定消旋卡多曲在人体内血药浓度的方法[4～6]，操作简便、快速、回收率高、方法灵敏、专属性强、样品分析时间短。因消旋卡多曲代谢物TP含有巯基，易被氧化，所以加入L-半胱氨酸保持样品稳定[7]。血浆中内源性物质对测定无干扰，完全可满足消旋卡多曲血药浓度测定及生物等效性研究的要求。

药动学参数显示，法国Laboratoire Bioprojet Pharma公司研制的消旋卡多曲散剂与四川百利药业有限责任公司生产的消旋卡多曲颗粒在健康人体内的吸收、分布、消除较为接近。本试验为消旋卡多曲散剂临床用药的安全性和有效性提供了依据。

试验期间，受试者的依从性好，未发现违反试验方案中与受试者相关内容的现象；无受试者被剔除或退出试验；受试者未见不良反应。

[1] Schwartz JC.Racecadotril：a new approach to the treatment of diarrhoea[J].International Journal of Antimicrobial Agents，2000，14（1）：75.

[2]Primi MP，Bueno L，Baumer P，et al.Racecadotril demonstrates intestinal antisecretory activity in vivo[J].Aliment Pharmacol Ther，1999，13（1）：3.

[3] Kuijpers EA，Hartigh JD，Vermeij P.A stability study involving HPIC analysis of aqueous thiorphan solutions in the presence of human serum albumin[J].Pharm Dev Technol，1998，3（2）：185.

[4] 钟家庆，秦永平，余 勤，等.高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆中消旋卡多曲活性代谢物含量[J].分析化学研究简报，2008，36（1）：91.

[5] 徐 帆，尚北城，杜江荣，等.高效液相色谱法测定血浆中消旋卡多曲的浓度及其药动学[J].中国医院药学杂志，2006，26（11）：1 355.

[6] 秦永平，余勤奋，梁茂植，等.消旋卡多曲口腔崩解片相对生物利用度研究[J].中国新药杂志，2006，15（19）：1 691.

[7] 李见春，董海军，高 署.LC-MS/MS测定人血清消旋卡多曲活性代谢物及其应用[J].中国药学杂志，2008，43（13）：1 018.

Study on the Bioequivalence of 2 Kinds of Racecadotril Preparations in Healthy Volunteers

LI Yan，ZHOU Lun，YANG Jing，JIA Yan-yan，SONG Wei，FENG Zhi-jun，LU Cheng-tao，CHEN Min-chun，WEN Ai-dong
（Dept.of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China）

OBJECTIVE：To study the bioequivalence of Racecadotril pulvis and Racecadotril granules.METHODS：A randomized crossover design was performed in 20 healthy male volunteers.A single oral dose of Racecadotril pulvis（200 mg，test preparation）or Racecadotril granules（200 mg，reference preparation）were administrated.Plasma concentrations of racecadotril were determined by LC-MS.The pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 software and the bioequivalence was evaluated.RESULTS：After a single oral dose of 200 mg test preparation or reference preparation，the main pharmacokinetic parameters were as follows：cmax（286.54±66.14）ng·mL－1and（283.73±65.49）ng·mL－1；tmax（1.78±0.48）h and（1.68±0.79）h；t1/2（4.02±1.26）h and（4.00±1.11）h；AUC0～24h（1 353±431）ng·h·mL－1and（1 293±320）ng·h·mL－1.There was no significant difference between the two preparations in pharmacokinetic parameters by variance analysis，t test and 1－2α confidence interval method（P＞0.05）.The 90%confidence intervals of cmax，AUC0～24hand AUC0～∞of test preparation were 92.2%～111.1%，98.1%～107.7%and 98.6%～108.3%.CONCLUSION：Racecadotril pulvis and Racecadotril granules are bioequivalent in healthy volunteers.

Racecadotril；LC-MS；Bioequivalence；Pharmacokinetics

R969.1

A

1001-0408（2012）30-2836-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.30.21

＊副主任药师，硕士。研究方向：基因药物。电话：029-84775476。E-mail：kevin@fmmu.edu.cn

#通讯作者：主任药师，博士。研究方向：新药研发及临床试验管理。电话：029-84773636。E-mail：adwen@fumm.edu.cn

2011-10-21

2012-01-20）