CD4+CD25+调节性T细胞变化对慢性乙型肝炎HBeAg血清学转换的预测价值及白花香莲解毒方的干预作用*

邱 华 韦艾凌 胡振斌 盛庆寿 程万里 余胜民

1.广西中医药大学第一附属医院肝病科 (广西南宁，530023) 2.广西中医药大学附属瑞康医院3.广西第四人民医院 4.广西壮族自治区壮医医院

CHB的抗病毒治疗是一个复杂而长期的过程，治疗个体的应答情况不尽相同，如能在治疗的早期准确预测患者远期疗效，将有助于优化个体治疗方案，提高应答率、降低耐药率、改善临床治疗结局。CD4+CD25+Tregs是导致乙型肝炎慢性化及机体对乙肝病毒 (HBV)特异性免疫功能低下的重要因素之一［1］。HBeAg血清学转换是CHB患者免疫功能恢复的重要标志，是HBeAg阳性CHB抗病毒的满意治疗终点之一［2］。壮药白花香莲解毒方具有较好的抗HBV、护肝等作用［3～5］。本研究拟评估 CD4+CD25+Tregs比率变化对CHB治疗48周HBeAg血清学转换发生的早期预测价值及白花香莲解毒方的干预作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 240例均为2009年1月-2010年12月来源于广西中医药大学第一附属医院、广西中医药大学附属瑞康医院、广西第四人民医院、广西壮医医院的HBeAg阳性的CHB患者。

纳入标准:参照《慢性乙型肝炎防治指南》［6］中诊断标准。①符合HBeAg阳性CHB诊断标准［6］;②HBV DNA 105～108copies/ml;③ALT 2～10×ULN(正常值上限)，TBil≤3×ULN;④年龄18～65岁 ;⑤为使用核苷类似物初治者;⑥未合并其他严重并发症者。

排除标准:①不符合诊断标准者;②曾应用核苷类似物抗病毒药超过1年现临床判断属于耐药、变异者;③血清学检测证实由肝炎病毒重叠感染 (尤其是丙肝病毒重叠感染)和/或感染HIV(人类免疫缺陷病毒)、非病毒感染 (如酒精性肝病、自身免疫性肝病)引起的慢性肝炎或隐源型肝炎者;④妊娠或准备妊娠妇女，哺乳期妇女，男性准备授孕者;⑤合并严重的心、脑、肾疾病者;⑥依从性差者。

由SPSS 18.0产生随机数字表，按照患者纳入先后，随机分为试验组、对照组各120例。剔除5例，最终共完成235例，试验组118例，对照组117例。试验组男101例，女17例，平均年龄 (34.54±12.24)岁，HBV DNA载量 (7.06±0.86)log10copies/ml，肝功能ALT(173.41±64.17)U/L;对照组男98例，女19例，平均年龄 (33.17±10.15)岁，HBV DNA载量 (6.92±0.75)log10copies/ml，肝功能ALT(165.83±67.42)U/L。两组患者的基线资料比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。同时招募健康志愿者20例作为健康对照组，其中男、女各10例，平均年龄 (32.32±7.51)岁。

1.2 治疗方法 两组患者均给予休息，清淡优质蛋白饮食，对照组:阿德福韦酯胶囊 (成分阿德福韦酯，江苏正大天晴药业股份有限公司)10mg/次，1次/d;试验组:阿德福韦酯胶囊10mg/次，1次/d加白花香莲解毒方 (由白花蛇舌草、三叶香茶菜、黄花倒水莲、排钱草组成，采用中药免煎配方颗粒，购自江阴天江药业有限公司，统一配送各研究中心)开水冲服，2次/d。研究期间禁止使用其他具有抗HBV、免疫调节以及抗炎保肝作用的中西药物;但若在试验用药过程中出现ALT＞10ULN情况时，则从安全性角度出发，可加用保肝降酶类药物如甘草酸苷类或还原型谷胱甘肽。

1.3 主要试剂 人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司;抗人CD4-FITC(Fluorescein Isothio，异硫氰酸荧光素)、CD25-PE(Phycoerythrin，藻红蛋白)单克隆抗体及同型对照小鼠IgG2a-IgG1抗体，均购自美国Beckman Coulter公司;HBeAg/HBeAb试剂盒购自美国罗氏公司。

1.4 观察指标及检测方法 ①外周血CD4+CD25+Tregs的测定:清晨空腹采集外周血5ml，肝素抗凝，迅速分离外周血PBMC，取2×105个PBMC加入抗人荧光标记抗体 (CD4-FIFC、CD25-PEmAb)，室温避光孵育20分钟后，1000r/min离心10分钟，弃上清液，采用2ml PBS重悬细胞沉淀，1000r/min离心10分钟，弃上清液，500μl PBS重悬细胞沉淀，上流式细胞仪 (美国Beckman Coulter公司)检测CD4+T细胞和CD4+CD25+Tregs细胞数量。每份标本均设同型对照，数据采用 Cell Quest软件进行分析。CD4+CD25+Tregs比率=CD4+CD25+Tregs数量/CD4+数量×100%。②HBeAg/HBeAb的检测:采用罗氏公司提供的HBeAg、HBeAb试剂盒，ELISA法检测。

1.5 统计学方法 应用SPSS 18.0软件统计分析。计量资料以()表示，组间比较采用成组设计的t检验，治疗前后比较用配对t检验，率的比较采用卡方检验，CD4+CD25+Tregs的预测价值应用ROC进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脱落情况及原因 本研究累计脱落20例，试验组8例，对照组12例，观察期均≥12周。其中因出现重症化倾向者两例 (两组各1例)，对照组发生CK(肌酸激酶)显著升高者1例，自觉疗效不佳者6例 (实验组2例，对照组4例)，对某些不良反应感到难以忍受者3例，失访者8例。为了减少统计学偏倚，按照意向分析 (ITT)原则，对于无论何种原因退出试验的病例，以其最后一次的检测结果结转为最终结果，对其疗效进行全数据分析。

2.2 两组HBeAg/HBeAb血清学转换比较 见表1。

表1 两组患者HBeAg/-HBeAb血清学转换率比较

2.3 各组人员外周血CD4+CD25+Tregs比率的比较见表2。

表2 各组人员外周血CD4CD25Tregs比率的比较 ()

表2 各组人员外周血CD4CD25Tregs比率的比较 ()

与健康对照组比较，#P＜0.05;与对照组同时段、同项目比较，▲P＜0.05

2.4 CD4+CD25+Tregs变化对HBeAg血清学转换的预测价值分析 见表3。以治疗12周CD4+CD25+Tregs比率下降值预测48周HBeAg血清学转换的ROC曲线下面积为 0.935，最佳的 Cutoff值为3.21%，敏感度为93%，特异度为85%，准确性为91.7%。见图1。

表3 48周获得/未获得HBeAg血清学转换CD4+CD25+Tregs比率的比较()

表3 48周获得/未获得HBeAg血清学转换CD4+CD25+Tregs比率的比较()

与健康对照组比较，#P＜0.05;与未获得HBeAg血清学转换组同时段、同项目比较，▲P＜0.05

图1 治疗12周CD4+CD25+Trges比率变化预测48周HBeAg血清学转换的ROC曲线图

3 讨论

目前抗病毒可供选择的药物越来越多，探寻CHB抗病毒远期应答的早期预测方法，尤显重要。目前提出了一些CHB抗病毒应答的预测因子，如ALT水平、肝炎活动度、HBV DNA载量、HBV基因型、HBsAg滴度及宿主IL-28B基因型等，对指导临床发挥着一定的作用［7～9］。但这些预测因子存在着一些不足:①片面性，抗病毒是药物、宿主及病毒三者共同作用的过程，仅仅从某一单方面进行评估，将影响其预测结果的准确性;②表象性，如ALT水平、肝脏炎症活动度是机体免疫功能激活，清除HBV过程中，在生化、组织及器官水平的外在表现，并不能直接等效于机体免疫功能状态;③延迟性，如目前应用最广泛的基于治疗期间HBV DNA载量下降程度的疗效评估方法，多以治疗后24周，甚至更长时间作为应答的评估节点，一定程度上增加了患者的经济负担及耐药风险;④局限性，如HBV基因型、宿主基因型及HBsAg滴度仅对干扰素治疗的应答预测有指导作用;⑤易干扰性，如ALT水平易受护肝药物应用、合并症、年龄、休息等因素的影响。因此，继续探寻CHB抗病毒疗效的预测因子仍然非常必要。近年人们逐渐认识到机体的HBV特异性免疫功能低下是导致乙型肝炎慢性化、HBV DNA持续复制的核心机制;宿主免疫状态才是决定乙型肝炎临床转归和抗HBV疗效的关键性因素［10］。因此，从免疫角度建立CHB抗病毒应答的预测系统将具有更高的准确性、提前性、适用性及稳定性。

CD4+CD25+Tregs是一群具有自身免疫无能和免疫抑制特性的T淋巴细胞。研究发现，CHB患者外周血及肝脏内CD4+CD25+Tregs数量显著增加，其可通过抑制HBV特异性的T细胞增殖和CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应，导致乙型肝炎慢性化及HBV DNA持续复制［11］。最新研究结果提示，CD4+CD25+Tregs水平可能与CHB的抗病毒疗效，尤其是HBeAg血清学转换率密切相关。张梦军［12］报道替比夫定能够降低CHB患者外周血CD4+CD25+Tregs水平，改善机体的免疫应答能力，从而实现快速抑制HBV复制，提高 HBeAg血清学转换率的作用。Sprengers等［13］发现聚乙二醇干扰素治疗HBeAg阳性CHB，无应答者的外周血中CD4+CD25+Tregs频率增加，而获得持续应答者却没有，提示 CD4+CD25+Tregs与聚乙二醇干扰素抗HBV无应答有密切关系。HBeAg是HBV复制活跃的重要血清学指标，在抗病毒治疗基础上发生的HBeAg血清学阴转或转换是CHB病情好转或稳定的重要标志。前期研究发现，壮药白花香莲解毒方能显著抑制 HepG2.2.15细胞分泌 HBsAg、HBeAg，并具有较好地抗HBV、护肝降酶及改善生存质量等临床疗效，但其机制尚未明确。

本研究发现，HBeAg阳性 CHB患者外周血CD4+CD25+Tregs比率较正常人群显著升高;发生HBeAg血清学转换组第12周的CD4+CD25+Tregs比率较治疗前明显下降，其预测48周HBeAg血清学转换的ROC曲线下面积分别为0.935，敏感度为93%、特异度为85%，说明该指标具有作为HBeAg阳性CHB患者抗病毒满意治疗终点预测因子的应用价值;壮药白花香莲解毒方能提高HBeAg血清学转换率，其机制可能与降低CD4+CD25+Tregs比率，恢复机体对HBV的特异性免疫功能有关。

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