莫诺苷对二磷酸腺苷诱导兔血小板聚集钙离子的影响①

艾厚喜，左玮,，王晓锋，张丽，季晖，陈乃宏，王文

心脑血管疾病发病率在日益提高，给社会和国家带来巨大负担，抗血小板聚集药物在防治心脑血管疾病过程中起着重要作用。20世纪50年代以后，采用活血化瘀法治疗心脑血管疾病等取得引人注目的进展。研究活血化瘀中药的活性成分，进而开发出新药，是中药现代化研究的课题。

山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)是山茱萸科植物，性微温，味酸、涩，归肝、肾经，具有补益肝肾，涩精固脱的作用。环烯醚萜苷是本室研究得到的山茱萸有效成分。对山茱萸环烯醚萜苷进一步分离，得到莫诺苷(morroniside)。前期研究发现，莫诺苷对SH-SY5Y神经细胞具有抗氧化、抗凋亡等保护作用[1-4]；莫诺苷能减小大鼠局灶性脑缺血再灌注模型脑梗死体积[5]，抑制皮层脂质过氧化作用[6]。此外，莫诺苷能显著抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)和血小板活化因子(platelet activation factor,PAF)诱导的兔血小板聚集的作用，尤其对ADP的抑制作用选择性强[7]。血小板聚集和胞浆中游离Ca2+浓度的升高密切相关。本文通过体外研究莫诺苷在ADP诱导血小板聚集后对Ca2+含量的影响，进一步从分子角度探讨莫诺苷抗血小板聚集的可能机制。

1 材料与方法

1.1 药物 莫诺苷由本室从山茱萸中提取制备，高效液相分析，纯度约98.5%。乙酰水杨酸(acetylsalicylic acid,ASA)为SIGMA公司产品，用时用蒸馏水溶解，以0.1 mol/L NaHCO3调pH至7.0左右，再加蒸馏水稀释到所需浓度。

1.2 试剂 ADP：SIGMA公司，配制成7.5 mg/ml储存液，分装，-20℃密封保存，临用前稀释，终浓度为10 μmol/L；Fura-2 AM：美国Quantikine公司。

1.3 动物及仪器 新西兰大耳白兔：体重(3.0±0.5)kg，SPF级，由北京开源兔业养殖场提供，合格证号SCXK(京)2006-0005；SC-2000 Microfuge低温离心机：美国BECK-MAN公司；IMT22型全自动酶标仪(LP400型)：法国Diagnostic Pasteur。

1.4 方法

1.4.1 血小板的制备[8]取新西兰大耳白兔，用3%戊巴比妥钠30 mg/kg耳缘静脉缓慢注射麻醉，固定于兔台上，颈总动脉插管取血，与3.8%枸橼酸钠抗凝剂按9∶1(V/V)混匀。230 g离心10 min后取上清液即富含血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)，再将PRP 800 g离心15 min，得沉淀即血小板。

1.4.2 负载血小板悬液的制备 血小板经无钙Hepes buffer轻轻洗涤2次，然后用无钙Hepes buffer重悬，调血小板的密度为(400～500)×109/L；加入终浓度2µM的Fura-2 AM，37℃恒温避光振摇负载1 h。

1.4.3 血小板Ca2+的测定 经500 g离心负载血小板悬液，取沉淀用无钙Hepes buffer轻轻洗涤2次，去除多余的Fura-2 AM；再用无钙Hepes buffer重悬，加入含钙Hepes buffer，使其Ca2+终浓度为1 mmol/L。然后加入各组药品溶液，莫诺苷低、中、高剂量组分别3 mg/ml、6 mg/ml、12 mg/ml，空白对照组生理盐水，ASA组0.5 mg/ml。体外作用5 min；再加入ADP(终浓度为10µM)诱导聚集。双波长荧光分光光度计上作荧光测定，固定发射波长于510 nm，采用改变波长的时间扫描，激发波长分别固定在340 nm和380 nm，记录5 min内Fura-2在激发波长340 nm和380 nm处的荧光强度比值，即F340/F380值[9]。

1.5 统计学分析 采用SPSS 13.0统计学软件进行统计处理，结果以(±s)表示。应用一般线性模型(general linear model,GLM)的重复测量和多变量过程对重复测量数据进行重复测量方差分析和多元方差分析，并进行不同时间点和不同组间的两两比较。药物对Ca2+浓度变化的影响用F340/F380比值对时间变化表示。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 球形检验 Mauchly球形检验结果P＞0.05，说明重复测量数据之间实际上不存在相关性，资料满足Huynh-Feldt条件，可以用重复测量设计资料的单变量方差分析处理资料。见表1。

2.2 分析时间、分组因素的作用以及时间和分组之间的交互作用 个体内变异部分的计算结果显示，时间因素对Ca2+浓度有统计学意义(P＜0.05)，说明Ca2+浓度有随时间变化的趋势；时间和分组的交互作用有统计学意义(P＜0.05)，说明时间因素的作用随着分组的不同而不同。个体间变异部分有统计学意义(P＜0.05)，说明分组因素起作用。见表2。

表1 Mauchly球形检验结果

表2 主体内效应的检验

2.3 每个时间点上5个分组之间的两两比较 对1～5 min内5个时间点各组的F340/F380比值进行两两比较。与空白对照组相比，在1～5 min内ASA均能显著降低由ADP诱导血小板聚集引起的F340/F380比值的升高(P＜0.001)。莫诺苷的低、中、高剂量组均能降低ADP诱导血小板聚集引起的F340/F380比值升高，并且具有浓度依赖性，其中中、高剂量组比ASA组的作用还强。说明莫诺苷可以显著降低ADP诱导兔血小板聚集后Ca2+浓度的升高(P＜0.001)。见表3。

表3 不同时间点各组F340/F380值比较

3 讨论

血小板聚集和胞浆中游离Ca2+浓度的升高密切相关。Ca2+是血小板聚集和释放反应中重要的物质基础，作为活化信息的传递者通过活化磷脂酶A2作用于磷脂产生血小板活化的主要介质如血栓烷等[10-11]。静息的血小板胞质内的Ca2+浓度为100 nmol/L，在刺激剂的作用下其浓度可增1000 nmol/L以上。胞质内Ca2+浓度升高可引起血小板变形、分泌和聚集。Ca2+可通过很多途径如Ca2+-降钙素依赖性蛋白激酶、Ca2+依赖性蛋白激酶PLC、PLA和PKC激活血小板[12]。

本文着重通过测定莫诺苷是否能够抑制ADP诱导血小板聚集后引起的Ca2+的上升，探讨莫诺苷抗血小板聚集的可能机制。从实验数据来看，莫诺苷可以不同程度抑制ADP诱导兔血小板聚集后Ca2+的上升。从分子机制证明莫诺苷可能通过这一机制，发挥兔体外抗血小板聚集的作用。但是体内抗凝机制十分复杂，涉及到多种因素，因此对于莫诺苷抗凝机制还有待于进一步做更详尽的研究。

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