血三七药材提取工艺的优选研究

向梅先，史圣娟，郭宝男，马 牧

(中南民族大学 药学院，武汉430074)

血三七为蓼科植物中华抱茎蓼(Polygonum amplexicaule D.Don Var.sinense Forb.)的根茎［1］.中华抱茎蓼为多年生草本，其味涩微苦、性平小毒，有活血舒筋，行气止痛，抗菌消炎，止血生肌，收敛止泻之功效.用于跌打损伤，外伤出血，劳伤菌痢，胃肠炎等病［2］.在湖北、陕西等省民间广泛作为药用，是土家族、苗族、傈僳族常用的民族药和神农架7类药草之一［3］.傈僳族还用于风湿疼痛［4，5］.笔者前期研究了血三七的化学成分和促骨折愈合的药理机制，从该植物中分离得到40多个化合物，包括该药材的乙酸乙酯部位和从该部位分离得到的化合物大黄素，发现大黄素能促进成骨细胞的增殖和分化［6-8］.本文在前期基础上，拟将该药材的乙酸乙酯部位开发为新药—血三七胶囊，拟采用正交实验优选血三七胶囊的提取工艺，为该制剂的开发利用提供科学依据.

1 材料和仪器

血三七于2010年8月采自恩施，经中南民族大学万定荣教授鉴定为蓼属植物中华抱茎蓼(Polygonum amplexicaule D.Don Var.sinense Forb.)的根茎.

高效液相色谱仪(戴安UltimateTM3000型，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Chromeleon软件数据处理系统)，磷酸(20100227，天津科密欧化学试剂有限公司)，二甲基亚砜(2010072418，国药集团化学试剂有限公司)，乙酸乙酯(20100228，天津博迪化工股份有限公司)，甲醇(分析醇，2011121，国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(色谱醇，4L Class B A252-4 Methanol UN/230 LOT NO.061448 FL-07-0896，Fair Lawn，New Jersey 07410)，石油醚(20120228，天津博迪化工股份有限公司)，大黄素(100mg含量为96.5%HPLC，20120207，中国食品药品检定研究院).

2 方法与结果

2.1 正交实验因素水平设计

［9］，根以乙醇浓度和加入量，提取次数和时间，药材粉末粒径等为考察因素，以浸膏得率和大黄素的含量为考察指标，每因素设3个水平.采用L9(34)正交实验表进行试验，因素设计见表1.

表1 正交实验因素水平表Tab.1 Levels and factors of orthogonal experiment

2.2 浸膏得率的测定

按上述正交实验表1对血三七药材进行提取、过滤，回收溶剂得浸膏.浸膏用90%(V/V)的甲醇溶液溶解1～18号浸膏，用石油醚萃取，取下层溶液，蒸干.加适量蒸馏水溶解，成溶液，再按1︰1的体积比例加乙酸乙酯萃取3次，分离得到乙酸乙酯层，蒸干得浸膏，置真空干燥箱(70℃)中减压干燥成浸膏，衡重后，计算浸膏得率.浸膏得率(%)=所得浸膏种/药材量×100%.

2.3 样品中大黄素含量的测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱选择:色谱柱YMC-PACK ODS-A(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇-0.1 磷酸(85 ︰ 15)［10-13］;测定波长为 254 nm，柱温为 40℃，流速为1mL/min.

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称取大黄素2.65 mg，置1 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，得标准品.取1 mL标准品溶液置1mL容量瓶中，用甲醇稀释成0.08 mg/mL的溶液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为标准溶液备用.

2.3.3 供试品溶液的制备

取血三七乙酸乙酯层浸膏约80 mg，精密称定后置于EP管中，加入少许甲醇溶解，超声溶解10 min至全部溶解，得澄清透明溶液.移至1 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试液备用.

2.3.4 线性关系的考察

取上述对照品溶液，分别准确进样 2，4，8，12，16 μL，每个剂量重复3次.以峰面积y为纵坐标，进药量x为横坐标作标准曲线，得回归方程为:y=37.614x－0.0727，r=1，R2=0.9999，即在 0.16～1.6 μg(r=0.9999)范围内呈良好的线性关系.

2.3.5 样品含量测定

取上述供试液，分别准确进样20 μL，按上述高效液相色谱条件进行测定，采用外标法，计算样品中大黄素的含量，结果见图1和表2.

图1 血三七药材HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of Xuesanqi Medicinal material

表2 L9(34)正交试验结果Tab.2 Results of L9(34)orthogonal test

从干膏收率结果看，各因素对干膏收率影响的大小顺序为A＞B＞D＞C;在给定的水平条件下，各因素对收膏率的影响情况为A1＞A2＞A3;B3＞B2＞B1;C1＞C2＞C3;D2＞D3＞D1.故干浸膏收率的角度考虑，其优选工艺条件应为A1B3C1D2.从大黄素含量结果分析，各因素对干膏中大黄素含量的影响的大小顺序为C＞A＞D＞B;在给定的水平条件下，各因素对大黄素含量的影响情况为A3＞A2＞A1，B1＞B2＞B3，C3＞C1＞C2，D3＞D2＞D1.故从大黄素含量角度考虑，其优选工艺条件应为A3B1C3D3.方差分析A、C、D三因素对干浸膏中大黄素含量均有显著性的差异，故A选A3，C选C3，D选D3.B因素对无显著的影响.从节约酒精用量角度考虑，B选B1.综上所述，优选工艺条件为A3B1C3D3，取血三七根茎粉碎成中粉，加90%的乙醇加热回流提取2次:第1次加6倍量90%乙醇，加热回流提取1.5 h;第2次加4倍量90%乙醇，加热回流提取1h.

2.3.5 验证试验

按优选出的提取工艺条件进行重复试验3次，测定浸膏收率分别为 32.50，32.75，33.10 g，大黄素的含量分别为 2.57，2.64，2.73 mg，表明该优选工艺合理.

3 结语

本实验采用高效液相法测定了血三七乙酸乙酯部位的提取液中的大黄素含量，并在正交试验中，以干浸膏的收率和大黄素的含量为考察指标，优选出最佳的提取工艺.结果表明:大黄素标准品在0.16～1.60 μg(r=0.9999)线性关系良好，将血三七根茎粉碎成最粗粉，加90%的乙醇加热回流提取2次(第1次加6倍量90%乙醇，加热回流提取1.5 h;第二次加4倍量90%乙醇，加热回流提取1 h)为最佳提取工艺.

参考文献

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