雪上一枝蒿醇提物体外抗炎作用的研究

黄先菊，任 炜，潘 乐，陈芙蓉，邹大江

(中南民族大学 药学院，武汉430074)

雪上一枝蒿(Aconitum brachypodum Diel)为毛莨科乌头属多年生草本植物，是民间习用药物之一，资源丰富，性温，味苦、辛，有大毒，具有祛风除湿，消肿止痛之功效，主要用于治疗风湿性关节炎、关节疼痛等症.雪上一枝蒿化学成份主要为生物碱，含有甲、乙、丙、丁、戊、己、庚素，乌头碱，次乌头碱［1］，3-去氧乌头碱，3-乙酰乌头碱，雪乌碱，丽鲁碱，准葛尔乌头碱，欧乌头碱等.甲、乙、丙、丁素均有镇痛作用［2］，3-乙酰乌头碱(AAC)［3］对炎症早期毛细血管渗透性增高，炎性渗出和水肿，白细胞增多，以及炎症增殖期的肉芽组织增生均有明显抑制作用，并对正常动物体温和发热模型有解热降温作用.雪上一枝蒿速效止痛搽剂［4］能明显抑二甲苯所致小鼠耳廓炎性肿胀及醋酸引起的腹腔毛细血管通透性增加，具有局麻、抗生育等作用［5］;乌头属植物还具有一定程度的抗癌作用［6，7］.

有关雪上一枝蒿抗炎机制尚未见报道，本文旨在通过研究雪上一枝蒿醇提物(EABD)对LPS诱导的细胞活力和凋亡，及对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞释放NO和活性氧(ROS)的影响，初步探讨其抗炎作用和机制，为其开发利用提供理论基础.

1 实验材料

1.1 药品、试剂和动物

雪上一枝蒿购于安徽亳州.LPS(Biosharp)，Hoechst 33258、DCFH-DA(Sigma)，Griess ReagentⅠ、Griess ReagentⅡ(Beyotime)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，RPMI-1640细胞培养基(GIBCO，Invitrogen，USA)，噻唑蓝(MTT，Biotech)，二甲基亚砜(DMSO，天津科密欧化学试剂有限公司)，胰酶(Amerisco公司)，可溶性淀粉(天津市广成化学试剂有限公司)，NO检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)，其它试剂均为分析纯.SPF级雌性昆明小鼠(18～22 g)购自湖北省实验动物中心(许可证号:SCXK(鄂)2008-0005).

1.2 仪器

荧光显微镜(Nikon Corporation，Japan)，全自动酶标仪(上海 Thermo公司)，CO2培养箱(日本SANYO公司)，超净工作台(AIRTECH公司)，台式离心机(上海安亭科技器材厂)，精密天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，移液枪(上海DRAGON公司).

1.3 雪上一枝蒿醇提取物的制备

将原药材粉碎成粗粉，乙醇浸泡1周，抽滤、取其滤液，收集3次滤液旋转蒸干，制备雪上一枝蒿乙醇提取物(EABD)浸膏，提取率为12.95%.用前用DMSO溶解，稀释到所需浓度.

2 实验方法

2.1 EABD的HPLC色谱图的色谱条件

色谱柱Thermo Scientific Syncronis C18(4.6×250 mm，5 μm)，甲醇-0.1% 三乙胺梯度洗脱，柱温 30℃，检测波长240 nm，流速1 mL/min，进样量10 μL.

2.2 小鼠腹腔巨噬细胞的制备

小鼠腹腔注射1.0 mL无菌可溶性淀粉.3 d后处死，75%乙醇浸泡5 min灭菌.剪开小鼠腹部皮肤，注入腹腔5 mL无菌D-hanks，轻揉，无菌吸出腹腔冲洗液，1000 r/min离心5 min，取上清，加D-hanks吹散再离心.用含10%小牛血清的DMEM将细胞调节密度为2×106/mL后接种于相应(24，48，96孔)培养板中，37℃，5%CO2条件下培养2 h.细胞贴壁后，用D-hanks清洗细胞2次，去除消化后的非粘附和非分化细胞.

2.3 细胞活性分析

［8，9］，将密度为2×106/mL的小鼠腹腔巨噬细胞以每孔100 μL均匀点接种于96孔板中，细胞贴壁2h后先用1 μg/mL LPS诱导细胞损伤，再用1，50μg/mL EABD 37℃预处理24 h后，向96孔细胞板中加入5 g/L MTT，100 μL/孔，37℃孵育 4 h，弃上清，加150 μL DMSO/孔，震荡20 min使深蓝色甲瓒充分溶解，酶标仪上读出A492.细胞存活率(%)=(样品组A492/正常组A492)×100%，药物抑制率=(1－细胞存活率)×100% .

2.4 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡

将密度为2×106/mL的小鼠腹腔巨噬细胞以每孔500 μL均匀点接种于24孔板中.37℃，5%CO2条件下培养，待细胞贴壁(约2h).每孔先加入1 mL 10 μg/mL LPS后加入20，100μg/mL EABD，设LPS 对照和空白对照，每个浓度设2个复孔，培养24 h.弃上清，D-Hanks洗后加固定液(V(甲醇)︰V(冰醋酸)=3 ︰1)，D-Hanks洗后每孔加50 μL 5 μg/mL Hoechst溶液.经染色后室温暗室放置15 min，D-hanks洗2次，荧光显微镜下观察细胞形态并拍照.

2.5 活性氧检测

将密度为2×106/mL的小鼠腹腔巨噬细胞以每孔300 μL均匀点接种于48孔板中，待细胞贴壁(约2h).每孔加1 mL含10 μg/mL LPS的DMEM后加入20，100μg/mL EABD，设LPS 对照和空白对照，每个浓度设3个复孔，培养24 h弃培养液上清，按100 μL/孔加入以无血清培养液稀释1000倍的10 μm/L DCFH-DA.37℃孵育20 min.用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，去除未进入细胞内的DCFH-DA.用荧光显微镜观察并拍照.

2.6 NO 浓度检测

将密度为2×106/mL的小鼠腹腔巨噬细胞以每孔100 μL均匀点接种于96孔板中，细胞贴壁2h后，每孔分别加入1 μg/mL和10 μg/mL LPS后加入20，100 μg/mL EABD，设LPS对照和空白对照，每个浓度设6个复孔，培养24 h后取培养液上清于96孔板中，按50 μl/孔，再在各孔中室温加入Griess ReagentⅠ和Griess ReagentⅡ，标准品用DMEM稀释，浓度分别为1，2，5，10，20，40，60，100 μM，以10%DMEM加显色剂为空白对照，酶标仪测定各孔吸光度值A540.以NaNO2为标准品，按标准曲线回归方程求出待测样本NO浓度.

2.7 统计学处理

3 实验结果

3.1 EABD的HPLC色谱图

EABD和混合对照品(含雪上一枝蒿甲素、乌头碱等)的HPLC色谱图结果显示如图1.由图1可见，图1(a)中EABD的出峰时间为32.2 min，而图1(b)中乌头碱的出峰时间为32.3 min，故EABD中含大量乌头碱.

图1EABD和混合对照品(含EABD甲素、乌头碱等)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of EABD and mixed alkaloids(EABD Hypaconitine and aconitine)reference substance

3.2 EABD对LPS诱导的细胞活性和细胞凋亡的影响

MTT法检测EABD对LPS诱导的细胞活性的影响结果见图2.如图2a 所示，0.05，0.2，1，5，10 μg/mL的LPS均导致巨噬细胞存活率显著下降(P＜0.01)，且呈剂量依赖性.图2b中1，50 μg/mL EABD均可抑制1 μg/mL LPS造成的小鼠巨噬细胞损伤(P＜0.05和 P ＜0.01).

图2 EABD对LPS诱导的细胞活力的影响Fig.2 Effect of EABD on cell activity of mouse peritoneal macrophages induced by LPS

Hoechst 33258荧光染色法检测LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞凋亡结果见图3.由图3可见，细胞核形态规则，均匀的细胞为正常活细胞;细胞核或细胞质可见浓染致密的颗粒块状荧光和明显核形态裂化，有3个或3个以上的DNA荧光碎片为凋亡细胞;不为Hoechst染色的为坏死细胞［11］.10 μg/mL LPS 使细胞凋亡显著增加，20，100 μg/mL EABD 均能显著抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞凋亡.

3.3 EABD对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌ROS的影响

EABD对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞ROS的影响见图4.由图4中DCFH-DA荧光负载显示，10 μg/mL LPS组小鼠巨噬细胞内ROS水平明显增高，绿色荧光强度增强.20，100 μg/mL的EABD明显减弱细胞内绿色荧光强度，使胞内ROS释放减轻.

图4 EABD对LPS所致的小鼠腹腔巨噬细胞ROS的影响Fig.4 Effect of EABD on ROS production of mouse peritoneal macrophages induced by LPS

3.4 EABD对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO的影响

EABD对LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放NO的影响见图5.由图5 可见，1 μg/mL 和10 μg/mL 的LPS作用不同时间(48，72 h)均可引起小鼠腹腔巨噬细胞NO分泌增加.不同浓度的EABD(20，100 μg/mL)作用不同时间(48，72 h)均可抑制不同浓度两种浓度下LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞NO的释放.对1 μg/mL LPS作用48 h诱导小鼠腹腔巨噬细胞NO的释放的抑制作用更明显.按标准曲线方程求得不同浓度EABD作用后NO浓度回归方程为:y=42.7x－1.93，y为样本浓度(μM)，x 为样本吸光度值 A540，R=0.9993，线性关系良好，说明EABD抑制NO分泌呈浓度依赖性.

图5 EABD对LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放NO的影响Fig.5 Effect of EABD on NO production of mouse peritoneal macrophages induced by LPS

4 讨论

炎症的发生是一个复杂的过程，包括炎症细胞的聚集、增殖和炎症因子的产生，如NO、细胞因子、ROS和脂质代谢产物等.单核-巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等重要作用［12］.本研究观察EABD对小鼠腹腔巨噬细胞增殖活力、炎症因子NO表达和ROS生成的影响，阐述EABD的抗炎作用及可能机制.

从MTT实验、Hoechst33258荧光染色结果可知，较高浓度(1，10 μg/mL)的LPS可导致小鼠巨噬细胞存活率显著下降、凋亡细胞增加;EABD可显著提高小鼠巨噬细胞的活力，抑制小鼠巨噬细胞的凋亡，具有显著的体外抗炎作用.

NO在各种炎性疾病病理过程中起重要作用［13］，NO是在iNOS催化作用下将L-精氨酸生成L-瓜氨酸的反应中合成的小分子气体自由基，炎性反应时，主要由巨噬细胞生成，病理情况下，机体细胞均能表达iNOS，在炎性因子的刺激下产生NO.适量的NO有助于杀灭病原微生物、减轻炎性反应等.炎性或免疫性刺激下巨噬细胞产生的大量NO，可与超氧阴离子等氧自由基反应，增加了其对组织细胞的细胞毒效应［14］.Griess法实验结果显示EABD能够抑制巨噬细胞内NO的生成，使NO不能在巨噬细胞内过度表达.对NO所致的细胞毒作用减小甚至对细胞不产生细胞毒作用.

ROS参与了人体的衰老和诸多病理状态，如癌症、神经系统紊乱、糖尿病和缺血再灌注损伤.巨噬细胞内ROS水平是反映巨噬细胞功能的指标之一［15］.在机体免疫防御过程中，巨噬细胞通过产生一定量的ROS，破坏细菌的细胞膜和病毒的蛋白质以消灭外来病原微生物.研究表明，ROS在炎性反应的发生、发展中起重要作用［16］.当机体处于炎症过程中，巨噬细胞呼吸爆发会释放过量活性氧和其他炎症因子，造成组织损伤并成为炎症的重要病理过程［17］.若这些活性氧自由基过度产生就会使组织细胞坏死、溶解、凋亡严重损害组织，加重炎性反应.此外，ROS还通过一系列复杂的信号通路上调多种炎性细胞因子、炎性介质的表达，进一步加重炎性反应［18］.因此阻断活性氧自由基的合成与释放能起到一定的抗炎作用.本实验证实EABD能抑制巨噬细胞内活性氧的生成，进而抑制由活性氧自由基介导的炎性损伤，为其体外抗炎机制之一.

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