应用siRNA干扰下调CDX2表达以增强人胃癌SGC-7901细胞对5-Fu的敏感性

金雅磊 徐 理 李 春 叶旭军 袁 胜 王 桦 夏 冰

1.武汉大学中南医院综合科；2.湖北省军区武昌珞咖山离职干部休养所

我国胃癌发病率高，其死亡率又占各种恶性肿瘤之首位[1]。胃癌早期诊断率较低，进展期和中晚期胃癌手术年生存率低，因此临床上的化疗对胃癌的治疗具有重要意义[2]。5-氟尿嘧啶(5-Fu)是目前临床上最常用的化疗药物之一，但长期应用后容易出现耐受现象。多药耐药(MDR)是胃癌化疗失败的重要原因之一[3]。

Caudal type no-meobx transcription factor 2(CDX2)是最近发现的特异性核转录因子，在正常生物发育过程中，CDX2对消化道的发育起着关键的作用[4]。近年来研究发现，CDX2基因过表达是胃癌[5-7]发生发展中的关键因素之一，提示该基因可作为一个候选的肿瘤转移抑制基因。最近研究发现过度表达的CDX2通过增强启动子区域的活性促进MDR1的大量表达[8]，从而产生化疗药物的耐药性。因此我们推测降低胃癌细胞中的CDX2表达也许可以增强胃癌细胞对5-Fu的药物敏感性。本研究拟通过检测CDX2基因沉默能否增强胃癌细胞5-Fu化疗敏感性，从而为胃癌的化疗开辟新途径。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 RPMI-1640粉剂(美国Gibco BRL公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、Triton-X-100(Biorad公司)、鼠抗人CDX2单克隆抗体购自美国BIOGenex公司，5-Fu购自江苏豪森药业公司，针对CDX2基因的siRNA和阴性对照siRNA均为为上海吉玛制药技术有限公合成，其中阴性对照siRNA为对CDX2基因无干扰作用的双链RNA，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司。其余均为国产分析纯试剂。

1.1.2 细胞株 人胃癌细胞SGC-7901由武汉大学培养中心提供，用含有100 mg/L胎牛血清、100 ku/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPM1640培养基，在37℃、饱和湿度及50 ml/L CO2的细胞培养箱内传代培养。

1.2 方法

1.2.1 试验分组 实验分为5组：空白对照组、脂质体组、5-Fu组、siRNA组和5-Fu+siRNA联合组；每组设5个复孔。

1.2.2 细胞转染

1.2.2.1 寡核苷酸序列 针对人类CDX2基因mRNA序列中位点(NCBI GenBank，基因编号：NM-001265)，利用 “siRNA Target Finder Tool”(Genscript公司)设计软件，靶向CDX2基因siRNA寡核苷酸由上海生工公司化学合成，寡核苷酸序列见表1。

1.2.2.2 操作过程 用T4DNA连接酶将双链寡核苷酸与Psilencer2.1线性载体定向连接后转化大肠杆菌DH5а，植入固体LB培养液。挑选氨苄青霉素抗性菌落并扩增培养。将1×105个SGC-7901细胞接种于6孔板，其融合达90% 时分别用Psilencer2.1阳性重组子和对照阴性重组子进行转染。转染48 h后按1∶10稀释传代并换用选择培养液(600 mg/L，G418)继续培养14 d，然后将出现的细胞克隆在培养瓶中扩增培养并传代建系，分别命名为SGC-7901/Silence(+)和SGC-7901/Silence(－)细胞。

表1 寡核苷酸序列

1.2.3 Western blot方法检测 CDX2基因蛋白表达 收集各组细胞，洗涤、裂解液后低温离心5分钟，取上清，Forlin酚法测蛋白浓度。进行12.5%Tris一甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶和5%的积层胶电泳、转膜、封闭。分别加入一抗兔抗人CDX2及β-actin多克隆抗体，4℃孵育过夜，碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG孵育2h，四唑硝基蓝(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP)显色。一抗及二抗浓度均为l:1 000，用图像分析系统测定各条带的灰度值，并用Image J图像分析软件分析。以β-actin为内参，表示CDX2蛋白的相对表达强度。

1.2.4 免疫荧光显微镜检测细胞凋亡形态 我们使用免疫荧光显微镜对筛选出的表达CDX2 shRNA和Nonsilence shRNA的SGC-7901细胞进行检测。

1.2.5 MTT法检测细胞增殖抑制率 按同前实验分组，各组设5个复孔，分别收集转染前和转染后的细胞，按每孔1×104个细胞接种于96孔培养板，细胞贴壁后，根据分组加入所需试剂及药物。72 h后，每孔加入10μl的MTI'，继续培养4h，弃上清，加150μl的二甲基亚砜(DMSO)室温振荡10 min后570nm波长处测定光密度值(D570)。细胞抑制率(%)=(1-D570处理组／D570对照组)×100%。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS 11.0软件完成，比较两组之间数值的差异用t检验，多组之间则用方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1免疫荧光显微镜检测细胞凋亡形态图1显示，CDX2 knockdown组较non-silence组的细胞的绿色荧光平均强度明显减弱。

2.2 转染CDX2siRNA的SGC-7901对5-Fu敏感性的影响。 MTT法检测发现后三组(包括单用5-Fu组、转染siRNA组和5-Fu+转染siRNA联合组)对SGC-7901细胞的增殖有明显抑制作用，其中5-Fu+转染siRNA联合组抑制率最高，后三组与空白对照组比较差异具有统计学意义P<0.05，见表2。

图1 免疫荧光显微镜检测表达不同siRNA的SGC-7901细胞表面CDX2蛋白的表达水平。

表2 CDX2 siRNA对SGC-7901细胞增殖的抑制作用(n=5,x±s,%)

2.3 CDX2蛋白的表达Wstern Blot法检测显示，5-Fu组、转染组和联合组CDX2蛋白的表达均下调，明显低于其余各组(P<0.05)，见表3。

表3 各组SGC-7901细胞中CDX2蛋白的表达(n=5,x±s,%)

图2 各组CDX2蛋白表达(Western-blot ECL图像)

3 讨论

我国胃癌发病率高，其死亡率居各种恶性肿瘤之首[1]，目前在胃癌患者的治疗中，许多患者由于主、客观原因失去了手术的机会。胃癌的化疗常需联合应用多种药物以提高疗效，然而对化疗药物产生耐药性的患者逐年增多，且化疗药物对人体正常组织的不良反应较大，这些情况依然是导致胃癌患者化疗失败的主要原因[2]。因此，为解决这些难题，研究对胃癌细胞更有选择性的新型治疗方法已成为当务之急。siRNA应用于抑制胃癌细胞不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定和基因治疗等方面开辟一条新思路，因此包括动物医学在内的诸多领域的应用也有非常广阔的前景。

CDX2是一种新发现的特异性的核转录因子，是尾型同源框基因家族中的一员[4]；是最近发现的特异性核转录因子。最早由Mlodzik于果蝇中分离成功，发现与Parahox家族呈高度的同源性[1]。近年来人类的染色体研究表明，CDXZ基因全长22～23kb，位于染色体的13q12-13，由3个外显子和2个内含子构成；与之对应的CDX2蛋白包含311个单氨基酸，通过螺旋一环一螺旋的方式结合于DNA的相应区域，以转录因子的形式调节DNA的表达。近年来，CDX2基因与胃癌的关系已逐步得以阐明。Camilo V[5]报道在胃腺癌细胞CDX2 mRNA和蛋白的表达均显著升高。Peleteiro B等[6]对270例胃癌研究后发现，80.0%的胃癌组织表现不同程度的CDX2阳性表达。研究发现，CDX2基因过表达与胃癌生长、转移生物行为的研究有关，通过CDX2基因沉默可以抑制胃癌生长[7]。我们的研究通过将CDX2特异性siRNA转染入SGC-7901细胞中，发现转染siRNA组和5-Fu+转染siRNA联合组中的CDX2蛋白表达减少，SGC-7901细胞的增殖也有明显抑制。我们的试验从蛋白水平验证转染CDX2 siRNA的干扰效果；也提示转染CDX2 siRNA联合5-Fu可以降低胃癌细胞的耐药性，提高化疗效果，从而为临床治疗胃癌提供了新思路。

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[4] Drummond F,Putt W,Fox M,et al.Cloning and chromosome assignment of the human CDX2 gene[J].Ann Hum Genet,1997,61(Pt 5):393-400.

[5] Camilo V,Barros R,Sousa S,et al.Helicobacter pylori and the BMP pathway regulate CDX2 and SOX2 expression in gastric cells[J].Carcinogenes is,2012,33(10):1985-1992.

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