加味四君子汤对增龄大鼠免疫系统的调节作用及其初步机制探讨

沈鹤 张力华 何学斌 郝栋 董玲玲

炎性衰老(inflamm aging)这一概念的核心就是机体的炎症稳态随着增龄而逐渐出现失衡，机体的促炎性反应与抗炎性反应的平衡也出现失调[1-2]。

有相关研究发现，白介素-2(IL-2)及其受体在老年机体中的表达水平明显下降[3-4]。夏世金等[2]研究发现在炎性衰老的进程中，TNF-α蛋白的表达明显增加，说明促炎性细胞因子的蛋白正处于高表达状态、机体也处于一种高促炎性反应状态，机体的促炎性反应和抗炎性反应出现了平衡失调，从而加重了衰老发展的进程[5]。

多项研究表明，四君子汤具有多方面的生理活性，主要表现为可以调节机体各个器官的功能，增强免疫功能及抗氧化能力和应激能力，从而起到延缓衰老的作用[5]。

本研究旨在探讨加味四君子汤对增龄大鼠免疫系统的调节作用和改善大鼠免疫系统增龄变化的可能作用机制，为进一步临床应用防治或延缓衰老进程提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 动物 50只12月龄健康Wistar大鼠(湖北省医学科学院实验动物中心提供，雌雄各半，体质量(370±50)g。10只3月龄健康Wistar健康大鼠，雌雄各半，体质量(170±10)g。各组大鼠在大致相同条件下，分笼饲养于华中科技大学同济医学院附属梨园医院清洁动物实验室，室温(22±3)℃，相对湿度(65±5)%，通风良好，光照时间按照正常昼夜节律调节，标准饲料喂养，自由饮水、摄食，无不良因素影响。

1.2 药品制备与试剂 加味四君子汤由党参、白术、茯苓、甘草、黄芪组成，中药饮片购于武汉龙泰药业有限责任公司(产品批号:100101);经水煮醇沉法制备成含生药1 g/ml的药液，然后分别加入蒸馏水配置成试验所需的低、中、高不同浓度即0.25、0.5、1.0 g/ml的溶液，用无菌容器分瓶装入高温高压消毒后，于4℃保存，每次使用前加热至37℃。阳性对照组药物为河南皖西制药股份有限公司生产的六味地黄丸，将“六味地黄丸”丸剂研磨呈细粉状，加入蒸馏水煎煮，配制成含药0.24 g/ml的混悬液，每周制备1次备用，于4℃保存，每次使用前加热至37℃。免疫球蛋白IgG检测试剂盒购自宁波美康生物科技公司。检测IL-2和TNF-α的免疫组化试剂一抗、二抗均购自北京奥博森生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及药物处理:将50只12月龄大鼠随机分为5组:药物低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组、老年对照组，每组各10只，雌雄各半;3月龄Wistar大鼠10只作为正常青年对照组，雌雄各半。每日由梨园医院老研所动物房提供(购于湖北省医科院)的普通大鼠颗粒饲料及自来水。各组大鼠分别给予相应药物灌胃，依据实验大鼠与人体的体重药物比例系数换算，药物低、中、高剂量组:每日灌服1.6、3.2、6.4 g/kg。阳性对照组:给予六味地黄丸混悬液1.5 g/kg。老年对照组:给予生理盐水2 ml。每只大鼠分别于每日清晨进食前灌胃1次。每周称重1次，依据大鼠体重调整给药剂量，按照此法连续给药90 d。灌胃期间，因灌胃操作技术等原因药物低剂量组和老年对照组分别死亡2只和1只大鼠。

1.3.2 标本采集及处理:末次给药24 h后，空腹称量体重，于眼球后采血并用试管留置血样，处理后放置－20℃冰箱中保存，用于检测血清IgG的含量;摘除眼球后放血处死大鼠，于冰台上迅速剪开胸、腹腔，游离并摘除胸腺、脾脏，电子天平称量湿重，用于计算胸腺指数和脾脏指数;将胸腺和脾脏沿正中剖开，一部分置于20倍体积的4%多聚甲醛溶液中固定，以备用于常规石蜡包埋进行光镜与免疫组化检测。

1.3.3 观察指标及检测方法

1.3.3.1 血IgG测定:应用酶法在全自动生化分析仪上测定大鼠血清IgG含量。

1.3.3.2 胸腺指数和脾脏指数的测定:

胸腺指数=胸腺湿重(mg)/大鼠体重(g)。脾脏指数=脾脏湿重(mg)/大鼠体重(g)。

1.3.3.3 胸腺、脾脏组织形态学观察:将在多聚甲醛中固定后的胸腺、脾脏组织石蜡包埋，切片后以HE染色，光镜下观察组织的形态学改变。

1.3.3.4 胸腺IL-2、脾脏TNF-α表达检测:采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶法，阴性对照以磷酸盐缓冲液代替一抗。实验步骤严格按照使用说明书进行。应用同济医学院全自动医学彩色图文报告分析系统进行图像采集和结果数据分析。应用统计分析软件求得平均光密度值(OD)及灰度值，进行免疫组化染色半定量分析。

1.4 统计学处理 应用SPSS 15.0统计软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差(珋)表示;多组间均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，用最小有意义差异法(LSD)进行两两比较，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清IgG含量的比较 与青年对照组比较，增龄各组大鼠IgG水平均明显降低(P＜0.01);与老年对照组比较，阳性对照组和药物组的中剂量组和高剂量组的IgG明显升高(P＜0.05，P＜0.01)。与阳性对照组比较，药物组的IgG含量降低(P＜0.01)。见表1。

表1 各组免疫指标比较

表1 各组免疫指标比较

注:与青年组比较，＊＊P＜0.01;与老年对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01;与阳性对照组比较，##P＜0.01

组别 例数(n) IgG(g/L) 胸腺指数 脾脏指数 IL-2(OD) TNF-α(OD)青年对照组 10 6.01±0.51 1.78±0.44 5.32±0.26 0.27±0.05 0.31±0.04老年对照组 9 4.23±0.63＊＊ 0.49±0.23＊＊ 3.59±0.87＊＊ 0.13±0.01＊＊ 0.32±0.05＊＊阳性对照组 10 5.35±0.59＊＊△△ 0.49±0.35＊＊ 3.61±0.70＊＊ 0.17±0.00＊＊△△ 0.28±0.03＊＊△△药物低剂量组 8 4.23±0.52＊＊## 0.75±0.31＊＊△△##3.60±0.83＊＊ 0.14±0.00＊＊△△##0.28±0.08＊＊△△##药物中剂量组 10 4.39±0.31＊＊△## 0.63±0.35＊＊△△##3.15±0.68＊＊△△##0.26±0.09＊＊△△##0.28±0.08＊＊△△##药物高剂量组 10 5.13±0.40＊＊△△##0.80±0.14＊＊△△##3.82±0.77＊＊△△##0.20±0.09＊＊△△##0.29±0.04＊＊△△##

2.2 各组大鼠胸腺指数、脾脏指数的比较 与青年对照组比较，增龄各组大鼠胸腺指数均显著降低(P＜0.01);与老年对照组相比较，阳性对照组的胸腺指数无显著性差异，药物组的胸腺指数升高(P＜0.01)，以高剂量组升高最为显著;与阳性对照组相比，药物组胸腺指数升高(P＜0.01)。见表1。

与青年对照组比较，增龄各组大鼠脾脏指数均显著降低(P＜0.01);与老年对照组比较，阳性对照组和药物低剂量组的脾脏指数无明显差异(P＞0.05)，中剂量组的脾脏指数显著降低(P＜0.01)，高剂量组的脾脏指数显著升高(P＜0.01);与阳性对照组相比较，药物组低剂量组脾脏指数变化无明显差异(P＞0.05)，中剂量组的脾脏指数显著降低(P＜0.01)，高剂量组的脾脏指数显著升高(P＜0.01)。见表1。

2.3 胸腺组织形态学变化 增龄各组大鼠的胸腺组织与青年组相比明显萎缩，大部分的胸腺组织被结缔组织和脂肪组织所替代，胸腺的皮质、髓质明显变薄，可见少量的淋巴细胞及大量的浆细胞和巨噬细胞，小叶内的胸腺细胞数量明显减少，排列比较稀疏。与老年对照组比较，药物组和阳性对照组胸腺上述病理改变均有不同程度的减轻，胸腺细胞分布较密，着色良好。

2.4 脾脏组织形态学变化 增龄各组大鼠脾脏组织的结构紊乱，白髓和红髓的分界不清楚，白髓减少，巨噬细胞和中性粒细胞数量增多，淋巴细胞排列比较疏松，白髓中的纤维减少、红髓中的纤维增多、变粗。与老年对照组相比较，药物组和阳性对照组脾脏镜下观上述形态学改变有一定的改善，但白髓和红髓的分界欠清晰，白髓略微增多。

2.5 胸腺IL-2表达 青年组大鼠可见IL-2阳性细胞在胸腺内分布不十分均匀，在髓质中的分布比较密集，大部分集中在皮质和髓质的交界处以及髓质处;阳性细胞的胞浆被染成棕色或棕褐色颗粒，阳性表达的强弱程度不等;细胞的胞体比较大，形态各异;在细胞之间可以见到大量的、散在分布的阳性分泌物。

与青年对照组比较，增龄各组的胸腺组织的IL-2染色强度显著降低(P＜0.01);与老年对照组比较，阳性对照组和药物组的IL-2表达强度显著升高(P＜0.01)。中剂量组明显高于低剂量组和高剂量组;另外，与阳性对照组比较，高剂量组和中剂量组的表达明显升高，低剂量组的表达明显降低。见表1。

2.6 脾脏TNF-α表达 TNF-α表达在脾脏组织细胞的细胞膜和细胞浆中，其阳性信号主要位于中性粒细胞、单核巨噬细胞内，呈均匀的黄色或棕褐色细颗粒状。与青年对照组比较，老年对照组脾脏组织的TNF-α染色光密度显著增强(P＜0.01)。与老年对照组比较，药物组和阳性对照组表达量显著降低(P＜0.01)。TNF-α在低、中、高剂量组脾脏组织均可见阳性表达，其中低剂量组，中剂量组和高剂量组的表达量大致相同，高剂量组的表达量最高。中剂量组脾脏组织阳性表达量与阳性对照组无显著差异(P＞0.05)。见表1。

3 讨论

免疫衰老即免疫系统随着年龄的增长而发生的进行性退变，这种改变的逐渐积累则导致机体对感染和接种疫苗应答能力的降低[7]。随着年龄的增加，免疫器官老化，吞噬细胞的吞噬功能降低，细胞迁徙特性改变、细胞类群和数量以及抗体产生的能力等也发生相应变化，从而增加感染、细胞恶变和自身免疫性疾病的机会[8]。胸腺和脾脏是机体的免疫器官，胸腺随年龄的增长而逐渐萎缩，结果导致免疫功能下降。脾脏有合成和分泌免疫物质的功能，老年人的脾脏萎缩，同样导致免疫功能下降，免疫功能下降是造成机体衰老的原因之一[8]。

四君子汤为延缓衰老的代表方剂，作用缓和，疗效确切。四君子汤(人参、白术、茯苓、甘草)的近期研究结果证明，该方能够降低脂质过氧化物的含量和升高血清超氧化物酶的活力，具有抗自由基损伤的功能;可明显改善衰老小鼠的肝细胞超微结构，使其恢复正常状态;显著延长脾虚小鼠生命活力，增加其胸腺质量，提高免疫功能，降低实验动物血清中LEP和肝中脂褐素含量[5]。

本研究证实了加味四君子汤多途径、多环节、多靶点的整体调节机制。具有显著的延缓衰老的作用，其作用的发挥是通过多层次而实现的，其中包括调节免疫球蛋白、提高中央和外周免疫器官的功能、和改善因衰老所致的细胞形态学异常改变等方面。其发挥延缓衰老的作用往往以中、高剂量表现得更为全面和稳定，提示其在一定范围内呈量效关系。加味四君子汤具有提高老龄大鼠胸腺组织IL-2的水平，上调脾脏组织TNF-α表达的作用，从而说明延缓衰老作用的机理之一可能与提高免疫细胞因子的含量，控制免疫器官的炎性表达作用相关。同时可改善衰老大鼠胸腺和脾脏的组织学超微结构，通过维持细胞形态的正常，以确保其各项功能的发挥，从而起到延缓衰老的作用，这可能是其作用途径之一。研究结果表明，加味四君子汤具有一定的延缓老龄大鼠免疫系统炎性衰老的作用。

本实验研究了随着老龄大鼠的衰老变化，加味四君子汤具有延缓大鼠免疫系统衰老的作用，并探讨了其可能的作用机理。既为运用提高机体免疫功能原理延缓衰老提供了的理论依据，又为本复方临床应用提供了实验证据;既拓展了中医药防治衰老的思路，亦为该中药复方制剂的进一步研发奠定了前期工作基础。但本研究工作还只是初步研究，还未能进行更加深入的机理探讨。如果能应用先进的分子生物学技术，在基因水平上进行深入研究，阐明加味四君子汤更加具体的分子水平的延缓衰老的作用机制，将促进延缓衰老中药现代机理研究及临床推广应用。

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