牛外周血T淋巴细胞增殖试验条件的优化

肖 进，王 楠，巴利民，齐 鹏

（中国牧工商（集团）总公司，北京 海淀100095）

淋巴细胞增殖试验是体外检测T淋巴细胞功能的一种方法。淋巴细胞在体外培养条件下，与特异性抗原或非特异性有丝分裂原共同培养，使淋巴细胞的代谢和形态发生一系列的变化，可以使较小的淋巴细胞转化为体积较大、代谢旺盛，且能进行有丝分裂的淋巴母细胞。转化的淋巴细胞不仅能呈现出成熟的母细胞形态及蛋白质和核酸的增加，还能合成和释放细胞因子。因此可以使用淋巴细胞增殖试验反映机体的免疫状态［1］。

引起淋巴细胞增殖常用的刺激物大致分为特异性和非特异性两种：非特异性刺激物主要有刀豆蛋白 A（ConA）、植物血凝素（PHA）、美洲商陆（PWM）、脂多糖（LPS）等；特异性刺激物主要有疫苗、组织抗原、抗血清等。其中PHA和ConA为促T细胞有丝分裂原，LPS为促B细胞有丝分裂原［2］。淋巴细胞受到抗原或有丝分裂原刺激发生转化时，伴有DNA的大量合成，使淋巴细胞转化成淋巴母细胞。用于检测淋巴细胞增殖试验的方法主要有3种，即形态学方法、H－胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）掺入法和MTT法等。形态学方法简便易行，不需要特殊设备，但受试验条件变化差异较大，重复性和客观性较差，也不适用于大批量的检测。H－胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）掺入法是体外淋巴细胞增殖试验客观性较好的方法，其结果客观、准确、重复性好，但是需要一定的设备条件，而且存在放射性污染的危险，因此一般实验室开展这方面的研究受到了限制。1983年 Mosmann T R［3］建立了四甲基偶氮唑（MTT）比色法，该方法简便、迅速、准确、安全价廉，已经在生物学和医学的许多研究领域中用于检测细胞毒性、细胞活性和细胞增殖试验。本试验参考犬和鸡等其他动物增殖试验方法［4］，探讨牛淋巴细胞增殖试验的最佳试验条件。

1 材料与方法

1.1 试验用牛 挑选品种、来源相同，5月龄左右健康牛3头。

1.2 试验试剂 RPMI1640培养基（Gibco公司产品）；刀豆蛋白 A（ConA）（Sigma公司产品）；MTT（Ameresco公司产品）；胎牛血清（Hyclone公司产品）。配制分别含有5%、8%、10%胎牛血清的RPMI1640培养基（含有1%青、链霉素）。

1.3 方法

1.3.1 血液采集 使用无菌抗凝采血管分别采取3头牛的颈静脉血。颠倒混匀采血管，防止血液局部凝集。

1.3.2 分离淋巴细胞 取1份抗凝血，缓慢将其加至于2份的淋巴细胞分离液（购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）液面上，以2 000r／min离心20min。收集界面上的细胞层，加入5mL的Hank′s液（购自迈晨科技有限公司），充分混匀后，以2 500r／min离心20min，吸去上清液，沉淀用Hank′s液反复洗涤2次，最后用适量含有不同血清浓度的RPMI1640培养基将细胞分别稀释成2×105个／mL、2×106个／mL、2×107个／mL待用。

1.3.3 淋巴细胞的培养 将稀释为不同浓度的淋巴细胞分别加入至96孔细胞培养板中，每孔100 μL。将阳性刺激物ConA和阴性刺激物BSA分别过滤除菌，加20μL至培养板中，使二者终浓度分别为10μg／mL、2.5μg／mL；并设只有细胞不加刺激物的对照孔，只有培养基的本底孔；设5个重复，置于37℃，5%CO2分别培养48、60、72h。

1.3.4 MTT法检测增殖结果 细胞经过培养后，每孔加入MTT溶液20μL，继续培养4h。每孔加入DMSO150μL，稍振荡待沉淀物溶解后，于酶标仪波长为570nm处测定OD值。按照如下公式计算SI指数。

SI＝（刺激物OD值－空白对照OD值）／（阴性对照OD值－空白对照OD值）

2 结果

2.1 细胞浓度的选择 MTT法检测T淋巴细胞增殖，细胞浓度在一定范围内，MTT与活细胞线粒体脱氢酶相结合，形成的蓝色沉淀与细胞数量呈正相关。细胞浓度在2×107个／mL时，显微镜下观察细胞状态差；细胞浓度为2×105个／mL时，细胞状态良好，但是OD值与细胞浓度不存在线性关系；只有当T淋巴细胞数量在2×106个／mL时，显微镜下观察细胞状态良好，且OD值与细胞数量呈稳定的线性关系。因此确定分离培养的淋巴细胞浓度应使用2×106个／mL。

2.2 血清浓度的选择 本试验配制分别配制含有5%、8%、10%胎牛血清的RPMA1640培养基，分别对浓度为2×106个／mL的淋巴细胞进行培养，每个血清浓度的淋巴细胞分别培养48、60h和72h。经酶标仪在570nm处检测其OD值，计算SI指数，结果如图1所示。培养48h，随着血清浓度的提高，SI指数逐渐上升，血清浓度10%时，其SI指数最高；培养60h，其SI指数总体比48h的SI指数高，且随着血清浓度升高，其SI指数增大；培养72h，血清浓度为8%时SI指数最高。由此得出，当胎牛血清浓度为8%时，SI指数在60h和72h都很稳定，且数值较高，与10%浓度的SI指数没有显著区别，因此本着节约成本和降低本底的原则，确定胎牛血清最适浓度为8%。

2.3 培养时间的选择 在血清浓度为8%时，培养不同时间的SI指数关系见图2。随着培养时间的延长，SI指数逐渐上升。由48h至60h升高明显，由60h至72h升高不明显。说明培养至60h其淋巴细胞增殖效果良好，增加培养时间并没有使增殖明显升高。因此为了节省培养时间、降低成本，确定培养60h为最佳培养时间。

3 讨论

3.1 细胞浓度对增殖试验的影响 增殖反应的细胞应保持高活性，细胞浓度在一定范围内与OD值显示出较强的正相关，细胞浓度过高或过低，都不能正确反映细胞代谢情况，不利于细胞生长。刘民［5］等对小鼠脾脏淋巴细胞和胸腺淋巴细胞进行培养，发现脾脏淋巴细胞和胸腺淋巴细胞最佳应用浓度分别为1.5×106个／mL和3×106个／mL。马亚萍［6］等进行试验发现，小鼠脾淋巴细胞最佳培养浓度为1×106个／mL。林忠宁等［7］使用 MTT法进行T淋巴细胞增殖试验时对细胞浓度进行选择发现，当细胞在1×106个／mL～10×106个／mL范围内，随着浓度增高，OD差值逐渐增高，二者呈明显正相关（P＜0.01）。孔庆波［8］等培养犬外周血淋巴细胞确定细胞浓度5×106个／mL为最佳。

3.2 血清浓度对MTT法检测淋巴细胞增殖能力的影响 胎牛血清能促进淋巴细胞增殖，因此在淋巴细胞培养时被广泛使用，一般使用浓度为5%～10%［9－10］。当血清浓度超过10%时，OD值反而下降，原因可能是高浓度血清对淋巴细胞具有毒性作用。还有一种原因是高浓度血清可能会影响试验孔的光吸收值。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。

3.3 细胞培养时间对MTT法检测淋巴细胞增殖能力的影响 活化T细胞的有丝分裂使具有相同抗原特异性的细胞克隆得到扩增，从而大大增强了对特定抗原的免疫应答。T细胞经过TCR复合物刺激后，其有丝分裂活性可在体外培养48～72h后检测到。林忠宁等［7］培养小鼠、SD大鼠脾脏和人外周血淋巴细胞发现48h为最佳培养时间。郭松林等［10］认为培养鸭外周血淋巴细胞66h最优。孔庆波等［8］培养犬外周血淋巴细胞68h。本试验在48、60、72h3个时间下对细胞进行培养，以研究培养时间对淋巴细胞增殖的影响。结果表明，在相同条件下，60h培养效果最佳。

通过本试验得到牛外周血T淋巴细胞增殖试验的最佳条件为2×106个／mL的细胞，8%的胎牛血清浓度及60h的培养时间。

［1］章静波.组织和细胞培养技术［M］.北京：人民卫生出版社，2002.

［2］薛庆善.体外培养的原理与技术［M］.北京：科学出版社，2001.

［3］Mosmann T R.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.Journal of Immunological Methods，1983，65：55－63.

［4］Landsman T，Leitner G，Robinzon T B，etal.Effect of Gonadal Sterids on Proliferative Responses and Subset A lterations in Cultured Chicken Lymphocytes［J］.Poultry Science，2001，80（9）：1329－1338.

［5］刘民，马华，李柏青.MTT法检测小鼠淋巴细胞增殖性反应探讨［J］.中国实验动物学杂志，1999（3）：146－149.

［6］马亚萍，白剑英.MTT法探讨N－乙酞半肤氨酸对Na2S03小鼠脾淋巴细胞毒性的影响［J］.山西医科大学学报.2006（10）：1020－1021.

［7］林忠宁，董胜璋，董书芸，等.MTT法检测T淋巴细胞增殖功能的方法学探讨与应用［J］.中国卫生检验杂志，2000（1）：8－10.

［8］孔庆波，刘剑郁，常建军，等.犬淋巴细胞转化增殖试验最佳条件的确定［J］.畜牧兽医科学，2007（7）：47－49.

［9］王远阁，崔保安，张红英，等.黄芪板蓝根等多糖成分对鸡淋巴细胞体外增殖的影响［J］.河南农业大学学报，2007，41（2）：196－199.

［10］郭松林，关瑞章，冯建军.欧洲鳗鱼淋巴细胞转化试验条件的建立［J］.中国水产科学，2007，14（3）：403－410.