LTR对J亚群禽白血病病毒感染的影响

冯少珍，李 娇，吴晓婵，曹伟胜，廖 明

（华南农业大学兽医学院，广东 广州510642）

J亚群禽白血病病毒（Subgroup J avian leukosis virus，ALV－J）属于禽α反转录病毒属。Payne等在1991年首次在肉鸡中发现 ALV－J［1］，我国在1999年证实 ALV－J的存在［2－3］，2002年，首次发现蛋鸡存在J亚群禽白血病［4－5］。但不到10年的时间，全国已有相当多的鸡场发现该病，其主要临床表现为骨髓瘤、血管瘤、淋巴瘤、纤维肉瘤等多种肿瘤［6］，造成鸡群免疫抑制，并成为其他疾病的诱因。ALV－J可经种蛋垂直传播和水平传播，先天感染的子代鸡发生免疫耐受，导致免疫抑制。

长末端重复序列（LTR）是反转录病毒基因组两端的一段重复序列（5′LTR和3′LTR）。LTR与ALV的复制、转录、宿主范围、组织细胞嗜性及致瘤谱系的改变有关［7－12］。为了探讨LTR在骨髓瘤病变型ALV－J毒株NX0101产生免疫抑制中的作用，本试验通过反向遗传和搭桥PCR方法拯救重组病毒，将血管瘤病变型毒株HN06中两端的LTR序列替换至NX0101毒株的相应位置，通过人工后天感染模型，研究ALV－J在试验鸡体内分布及造成机体和免疫器官损伤的状况。

1 材料与方法

1.1 毒种和细胞 ALV－J骨髓瘤病变型NX0101克隆株由山东农业大学动物科技学院崔治中教授惠赠。ALV－J HN06株分离自发生血管瘤病变的病鸡内脏，通过反向遗传方法获得HN06克隆株［13］。DF－1细胞和抗ALV－J gp85单克隆抗体JE9由扬州大学兽医学院秦爱建教授惠赠。

1.2 重组质粒的构建 按照张纪元等报道的方法［14］，将 NX0101株前体基因组cDNA （GenBank登录号DQ115805）克隆至载体pMDTM18－T中，获得重组质粒pMDNX0101。根据NX0101株和HN06株前体基因组序列设计特异性引物（表1），通过搭桥PCR方法将HN06株前体基因组两端的LTR序列（5′端1－325bp，3′端7309－7633bp）分别替换至NX0101株前体基因组的相应位置，获得含有完整前体基因组结构的重组质粒pNX－HNLTR（图1）。

表1 引物序列

图1 重组质粒pNX－HNLTR构建

1.3 重组病毒NX－HNLTR株的拯救和鉴定 通过lipofectamineTM2000（Invitrogen公司），将重组质粒pNX－HNLTR转染至 DF－1细胞中，37℃，5%CO2培养3d后收集细胞培养上清。经免疫间接荧光（IFA）方法检测转染细胞以及经 ALV抗原ELISA检测试剂盒（IDEXX）检测细胞培养上清均呈阳性反应者，收集细胞培养物上清作为连续传代的接种物，并测定TCID50，病毒保存于－70℃。

按照赖汉漳报道的方法，利用抗ALV－J gp85单克隆抗体JE9对转染细胞进行IFA检测［13］，利用半定量方法对毒株进行定量，按照Reed－Muench氏法计算病毒的细胞半数感染剂量（TCID50）。

1.4 动物感染 7日龄SPF雏鸡120只，随机分为2个试验组和1个对照组，每组40只，隔离饲养。试验组分别通过人工腹腔接种104TCID50／0.2 mL的NX0101株和NX－HNLTR株，对照组不做任何免疫和攻毒。

1.5 检测指标和方法

1.5.1 体重和胸腺、脾脏、腔上囊重量 每天观察鸡群生长状态，各组在攻毒后不同时间点分别测量体重，解剖观察病变，并取胸腺、腔上囊和脾脏称重，计算免疫器官指数：免疫器官指数＝免疫器官重量（g）／鸡活体重（g）×100%。

1.5.2 组织病原学检测 采取鸡胸腺、脾、腔上囊等组织，提取总基因组DNA。按照Smith等方法［13］进行PCR检测病毒前体基因组整合水平。

1.6 统计分析 试验数据采用SPSS 11.5软件分析，并采用t检验法进行差异显著性分析，P＜0.05作为检验标准。

2 结果

2.1 重组病毒的拯救 通过搭桥PCR构建重组质粒pNX－HNLTR，PCR产物电泳和测序结果显示获得序列正确的片段。PCR扩增片段经过双酶切后连接至载体pMDNX0101中，测序显示HN06株基因组两端的LTR基因完整替换至NX0101株基因组的对应位置，获得重组质粒pNX－HNLTR。

重组质粒pNX－HNLTR转染 DF－1细胞，IFA检测结果表明，大部分细胞的细胞质出现特异荧光（图2），说明获得了ALV－J病毒粒子，克隆化重组病毒命名为NX－HNLTR。含有重组病毒NX－HNLTR的细胞培养物传8代，每1代细胞培养物上清均用ALV抗原ELISA检测试剂盒检验，结果显示，S／P比值均＞0.2，呈阳性，说明拯救的病毒粒子NX－HNLTR具有感染性。

图2 重组质粒pNX－HNLTR转染DF－1细胞3d后的IFA结果

2.2 ALV－J感染对体重及免疫指标的影响 如图3所示，在试验期1周开始，NX0101攻毒组的平均体重明显低于正常对照组，差异显著（P＜0.05）。NX－HNLTR攻毒组的平均体重在试验期4周内与对照组的差异不大，但6周时平均体重（199.5g）明显低于对照组（283g）（P＝0.043）。

图3 ALV－J感染后鸡只体重的变化

免疫器官指数分析结果显示（图4），攻毒组的胸腺、腔上囊和脾脏在攻毒后6周时萎缩最严重，免疫器官指数都显著低于对照组（P＜0.05）。试验期6周内，NX0101攻毒组的胸腺指数和腔上囊指数都低于对照组，但差异不显著（P＞0.05）；脾脏指数波动较大，在2周时达到最高峰，随后降低，6周时最小。NX－HNLTR攻毒组的脾脏指数在试验期内均低于对照组，胸腺和腔上囊指数与对照组的相比，时高时低，规律不明显。

图4 7日龄雏鸡感染ALV－J后免疫器官指数的动态变化

2.3 组织病原学检测和LTR对病毒感染的影响

PCR方法检测ALV－J在免疫器官分布的结果显示，感染NX0101株的鸡，骨髓和脾脏在攻毒后3周能检测到病毒基因，胸腺和腔上囊则在6周才能检测到；感染NX－HNLTR株的鸡在攻毒后2周，脾脏可以检测到病毒基因，骨髓和胸腺分别在3周和6周时才可检测到（图5）。

3 讨论

本试验将血管瘤病变型ALV－J毒株HN06中两端LTR序列替换至骨髓瘤病变型ALV－J毒株NX0101的相应位置，得到重组毒株NX－HNLTR。7日龄SPF鸡接种病毒NX0101和NX－HNLTR后，体重低于正常对照组，接种病毒HN06的鸡也出现体重下降的现象［16］，说明 ALV－J对鸡体生长有一定影响。接种了NX0101的鸡，胸腺和腔上囊指数明显低于正常对照组，胸腺和腔上囊的发育持续受到抑制。然而张利等［17］报道指出，接种了NX0101病毒（103TCID50）的鸡在感染后2周时，体重和免疫器官指数增加，随后在感染后5周内持续降低。结果有所差异，可能与攻毒量不同以及鸡只个体有差异有关。

图5 ALV－J在各感染鸡免疫器官的分布

从各免疫器官中病毒基因的整合情况来看，NX0101攻毒组和NX－HNLTR攻毒组在攻毒后2周和3周开始发现病毒基因整合至脾脏和骨髓基因组，胸腺和腔上囊在攻毒后6周时可检测到，而HN06攻毒组则在1周就检测到病毒基因整合至骨髓和脾脏，胸腺和腔上囊在攻毒后4周可检测到［16］。造血器官脾脏和骨髓是最先检测到病毒基因整合的，胸腺和腔上囊在攻毒后期才检测到病毒基因整合，也就是说病毒很可能最先感染的免疫器官是脾脏和骨髓，随后是胸腺和腔上囊。病毒基因整合至各器官的先后次序反映出病毒在免疫器官中的感染过程。研究表明，LTR与ALV的宿主范围和组织细胞嗜性有关［7－9］，LTR可能影响不同病变型ALV－J毒株感染不同组织的先后顺序。

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