吗啡对乳腺癌MCF-7细胞生存素及livin表达的影响

钱宁，孙灿林，姜琳，赵国军，蒋小芹，于鸿

(1.姜堰市人民医院麻醉科，江苏 姜堰225500;2.泰州市人民医院麻醉科，江苏泰州225300;3.泰州市人民医院病理科，江苏泰州225300)

吗啡作为一种临床常用的阿片类药物，广泛应用于终末期癌症疼痛及各种中重度非癌症疼痛治疗，其镇痛作用及机制已被深入研究。近年来的研究表明，吗啡可促进肿瘤细胞的凋亡并抑制肿瘤细胞的增殖，但具体机制并不十分明了。本研究通过观察不同浓度吗啡对体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞生存素(survivin)和livin表达的影响，探讨其促进细胞凋亡及抑制细胞增殖的机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人乳腺癌细胞株MCF-7(中国科学院上海细胞生物研究所)，DMEM、胎牛血清、RT-PCR试剂盒(Gibco公司，美国)，二甲基亚砜(DMSO)、四氮噻唑盐(MTT)、Annexin V-FITC试剂盒(Sigma公司，美国)，兔抗人survivin多克隆抗体、兔抗人livin多克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)，ABC试剂盒(Vector公司，美国)，吗啡(批号:110120－2，东北制药集团公司沈阳第一制药厂)，PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2 细胞培养及分组

人乳腺癌细胞株MCF-7培养于含10%胎牛血清、100 μg/ml链霉素、100 U/ml青霉素的 DMEM 培养液，37℃，5%CO2培养箱培养。取对数生长期细胞重悬，以1×103个/ml接种在6孔板内，培养24 h，采用随机数字表法，将MCF-7细胞随机分为3组:对照组，不作任何处理;0.1μmol/L吗啡组，加入终浓度0.1 μmol/L 吗啡;1.0 μmol/L 吗啡组，加入终浓度1.0 μmol/L 吗啡。每组18 孔。

1.3 RT-PCR法检测生存素和livin mRNA表达

于吗啡孵育24 h时，每组各取18孔细胞，用Trizol抽提总RNA，逆转录成cDNA，等量cDNA依照本实验室常规方法［1］进行PCR。PCR引物序列:内参照GAPDH上游5'-ACCACAGTCCATGCCATGCCATCAC-3';下游 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'，预计扩增片段长度为450 bp。生存素上游5'-GGACCACCGCATCTCTACAT-3';下游 5'-GCACTTTCTTCGCAGTTTCC-3'，预计扩增片段长度为338 bp。Survivin反应条件:50℃逆转录30 min，95℃灭活逆转录酶15 min，94 ℃ 变性2 min，60 ℃ 复性1 min，72 ℃ 延伸 1 min，共35个循环。livin上游5'-GTCCCTGCCTCTGGGTAC-3';下游 5'-CAGGGAGCCCACTCTGCA-3'，预计扩增片段长度为368 bp。内参照及livin反应条件同上。

1.4 蛋白质印迹法检测生存素和livin蛋白表达

于吗啡孵育24 h时，每组各取18孔细胞，经本实验室常规方法［2］使用细胞裂解液提取细胞总蛋白，用BCA法进行蛋白含量测定，依标准方法进行8%SDS-PAGE变性电泳，转移至PVDF膜。PVDF膜用10%羊血清37℃封闭10 min。一抗为兔抗人survivin多克隆抗体(1∶100)，兔抗人livin多克隆抗体(1∶100)，二抗为生物素化山羊抗兔多克隆抗体(1∶500，ABC 试剂盒)。

1.5 MTT法检测细胞增殖水平

分别于吗啡孵育24，48及72 h时，每组各取18孔细胞，将各组细胞以1×103个/ml细胞数接种于96 孔板中，每孔加入 MTT(5 mg/ml)20 μl，继续培养 4 h，每孔加入 150 μl DMSO，震荡 10 min，置酶标仪上检测490 nm波长处光密度(D)值。取18孔D值的平均值表示细胞增殖水平。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

于吗啡孵育24 h时，每组各取6孔细胞，重悬细胞，离心后弃上清，取细胞沉淀，采用Annexin VFITC试剂盒进行测定，以FACSCalibur流式细胞仪(BD公司，美国)分析，每孔重复测定3次，取平均值，计算细胞凋亡率。

1.7 定量和统计分析

凝胶电泳用凝胶成像仪进行拍照记录，Kodak Digital Science 1D扫描分析系统测定条带的积分光密度(ID)。采用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用成组t检验。

2 结果

2.1 生存素mRNA和蛋白表达的改变

RT-PCR 结果显示，与对照组相比，0.1 μmol/L吗啡组生存素 mRNA表达显著降低(t=18.375，P ＜0.01)，1.0 μmol/L 吗啡组生存素 mRNA 表达亦显著降低(t=16.241，P ＜ 0.01)，0.1 μmol/L 吗啡组与1.0 μmol/L吗啡组间差异无统计学意义(t=1.946，P ＞0.05)，见图 1。蛋白质印迹结果显示相对分子质量16 500蛋白条带(图2)。与对照组相比，0.1 μmol/L 吗啡组与 1.0 μmol/L 吗啡组生存素蛋白表达均显著降低(t分别为12.497和15.536，P 均 ＜0.01)，0.1 μmol/L 吗啡组与 1.0 μmol/L 吗啡组间差异无统计学意义(t=2.183，P ＞0.05)，见表1。

表1 各组细胞生存素mRNA及蛋白表达的改变x ± s，n=18Tab 1 The expression of survivin mRNA and protein in different groups

图1 RT-PCR法检测生存素mRNA的表达Fig 1 RT-PCR analysis for detecting Survivin mRNA

图2 蛋白质印迹法检测Survivin蛋白的表达Fig 2 Western blot analysis for detecting Survivin protein

2.2 Livin mRNA和蛋白表达的改变

RT-PCR 结果显示，与对照组相比，0.1 μmol/L吗啡组livin mRNA表达显著降低(t=12.458，P ＜0.01)，1.0 μmol/L 吗啡组 livin mRNA 表达亦显著降低(t=14.539，P ＜0.01)，0.1 μmol/L 吗啡组与1.0 μmol/L吗啡组间差异无统计学意义(t=2.844，P ＞0.05)，见图3。蛋白质印迹结果显示相对分子质量31 000蛋白条带(图4)。与对照组相比，0.1 μmol/L 吗啡组与 1.0 μmol/L 吗啡组livin蛋白表达均显著降低(t分别为11.227和9.675，P 均 ＜ 0.01)，0.1 μmol/L 吗啡组与 1.0 μmol/L吗啡组间差异无统计学意义(t=1.837，P ＞0.05)，见表2。

图3 RT-PCR法检测livin mRNA的表达Fig 3 RT-PCR analysis for detecting livin mRNA

图4 蛋白质印迹法检测Livin蛋白的表达Fig 4 Western blot analysis for detecting Livin protein

表2 各组细胞livin mRNA及蛋白表达的改变x ± s，n=18Tab 2 The expression of livin mRNA and protein in different groups

2.3 MCF-7细胞增殖活性的改变

MTT 结果显示，在吗啡孵育 24 h 时，0.1 μmol/L吗啡组和1.0 μmol/L吗啡组D值比对照组均显著降低，细胞增殖受到抑制，差异具有统计学意义(t分别为13.874 和15.367，P 均 ＜0.01)，0.1 μmol/L吗啡组与1.0 μmol/L吗啡组间差异无统计学意义(t=2.984，P ＞0.05)。在吗啡孵育 48 h 及72 h 时各组间差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 MTT检测各组细胞的D值x ± s，n=18Tab 3 MTT analysis for detecting D value in different groups

2.4 MCF-7细胞凋亡的改变

流式细胞仪凋亡检测结果显示，吗啡孵育24 h 时，对照组、0.1 μmol/L 吗啡组及1.0 μmol/L 吗啡组凋亡率分别为(6.09±1.34)%、(12.98±3.15)%、(12.92 ±3.27)%。与对照组相比，0.1 μmol/L吗啡组凋亡率显著增加(t=18.375，P＜0.01)，1.0 μmol/L吗啡组凋亡率亦显著高于对照组(t=16.294，P ＜ 0.01)，0.1 μmol/L 吗啡组与1.0 μmol/L吗啡组凋亡率比较差异无统计学意义(t=2.638，P ＞0.05)。见图 5。

图5 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率Fig 5 Flow cytomertry for detecting cell apoptosis ratio

3 讨论

Maneckjee 等［3］研究表明，0.1 ～1.0 μmol/L 吗啡可抑制人肺腺癌细胞增殖，并促进细胞出现DNA碎裂、凋亡小体形成等凋亡的特征性变化。覃怡等［4］报道，10 μmol/L 吗啡可抑制胃腺癌 MGC-803细胞增殖、促进细胞凋亡。Ecimovic等［5］报道，吗啡血浆浓度0.1 mol/L即可缓解乳腺癌患者疼痛，但用于癌痛治疗时，个体差异较大，因此本研究中吗啡浓度选择为0.1 μmol/L 及1.0 μmol/L，在上述浓度吗啡孵育乳腺癌MCF-7细胞后，结果发现，MCF-7细胞凋亡率显著升高，而细胞增殖显著降低，提示吗啡可促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡并抑制其细胞增殖，这与Maneckjee及覃怡等报道结果基本一致。

生存素和livin是凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族中近年来新发现的成员，在多种肿瘤细胞中高表达，参与抑制细胞凋亡，与肿瘤发生、发展密切相关，可作为肿瘤的早期诊断及预后评估的新靶点［6］。生存素还促进细胞转化，参与细胞有丝分裂、血管生成和肿瘤细胞耐药性的产生［7］。研究表明，生存素和 livin主要通过抑制Caspase的活性，阻断其级联反应，从而抑制凋亡的进程，另外也可通过激活TAKI/JNK1信号传导途径或参与TNF/NF-κB信号通路而发挥抗细胞凋亡作用［8］。本实验发现，用 0.1 μmol/L 及 1.0 μmol/L吗啡孵育后，MCF-7细胞生存素和livin蛋白及mRNA表达均比对照组显著减少，该结果提示吗啡可能通过下调生存素和livin的表达而抑制乳腺癌细胞增殖、促进乳腺癌细胞凋亡。然而，对于吗啡参与抑制恶性肿瘤的细胞增殖、促进细胞凋亡的作用机制还远未阐明。研究表明，吗啡除可与细胞表面Fas受体结合，通过FADD/P53信号通路促进细胞凋亡，还与TNF/NF-κB细胞凋亡信号通路存在相互作用或相互串话(cross talk)［9］。这些实验结果提示我们，在今后进一步研究吗啡在乳腺癌细胞增殖及凋亡中所起作用时，还必须加强Fas信号通路与其他信号通路之间的相互关系的实验研究，才能从本质上阐明其发生机制。

［1］刘庆宏，于鸿，黄俊星，等.Smad4基因对胰腺癌细胞E-cadherin、β-catenin表达及增殖的影响［J］.中华全科医学，2011，9(12):1831 －1832.

［2］许斌，肖蔚，焦霞，等.生存素反义寡核苷酸对乳腺癌MCF-7细胞株MMP-2及MMP-9表达的影响［J］.江苏大学学报:医学版，2011，21(3):203 －207.

［3］Maneckjee R，Minna JD.Opioids induce while nicotine suppresses apoptosis in human lung cancer cells［J］.Cell Growth Differ，1994，5(10):1033 －1040.

［4］覃怡，唐小曼，廖淳杰，等.吗啡对人胃癌MGC-803细胞p53 mRNA和E2F-1 mRNA表达的影响［J］.中华麻醉学杂志，2010，30(7):840 －842.

［5］Ecimovic P，Murray D，Doran P，et al.Direct effect of morphine on breast cancer cell function in vitro:role of the NET1 gene［J］.Br J Anaesth，2011，107(6):916 －923.

［6］Xi RC，Biao WS，Gang ZZ.Significant elevation of survivin and livin expression in human colorectal cancer:inverse correlation between expression and overall survival［J］.Onkologie，2011，34(8/9):428 －432.

［7］Kita A，Nakahara T，Takeuchi M，et al.Survivin suppressant:a promising target for cancer therapy and pharmacological profiles of YM155［J］.Nippon Yakurigaku Zasshi，2010，136(4):198 －203.

［8］Yan B.Research progress on livin protein:an inhibitor of apoptosis［J］.Mol Cell Biochem，2011，357(1/2):39 －45.

［9］Lin X，Li Q，Wang YJ，et al.Morphine inhibits doxorubicin-incuced reactive oxygen species generation and nuclear factor kappaB transcriptional activation in neuroblastoma SH-SY5Y cells［J］.Biochem J，2007，406(2):215－221.