超氧化物歧化酶活性的测定

史竞艳,罗辛茹,2,鲍江鸿,赵子德,黄丹,向乾坤

(1.武汉生物工程学院化学与环境工程系,湖北 武汉 430415;2.湖北大学化学化工学院,湖北 武汉 430062)

超氧化物歧化酶(SOD)是一种以超氧阴离子O2·-为底物的金属酶,能催化超氧自由基发生歧化反应,是机体内O2·-的天然消除剂,对机体细胞起保护作用,在防御O2·-的毒性、抗衰老[1]以及预防肿瘤和抗炎[2-3]等方面起着重要的生理作用.自1969年McCord和Fridovich[4]首次从牛红细胞中分离出超氧化物歧化酶以来,陆续在各种不同的生物组织都分离纯化出SOD,并对SOD的物理、化学、药理、临床和作用机理等方面进行了广泛研究,建立了多种活力测定方法[5].其中采用较多的是邻苯三酚法,这种方法具有操作简单、快速、试剂便宜且用量小、重复性好等优点,但文献报道的邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶活性的测定条件各不相同,而且研究的影响因素不够全面,这就造成了测定结果的混乱和缺乏可比性,为此我们对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的实验条件进行详细研究,探讨测活体系中缓冲溶液的pH值、温度、所含EDTA的浓度、邻苯三酚的浓度以及SOD酶浓度等因素对测定结果的影响,找出邻苯三酚测定超氧化物歧化酶活性的最优条件,其结果可对实际工作起到一定的指导作用,也可为进一步的酶促反应动力学研究提供实验和理论依据.

1 实验部分

1.1试剂与仪器试剂:牛血SOD(98%,活力为3 000 U),三羟甲基氨基甲烷(Tris,99.9%),盐酸(开封东大化工有限公司),乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2,99.0%,天津市风船化学试剂科技有限公司),邻苯三酚(贵州遵义佳宏化工有限责任公司),均为国产分析纯试剂,水为二次蒸馏水.

仪器:SP-1920UV系列双光束紫外-可见分光光度计,pHS-3E型数字酸度计,电子天平(BSA124S),恒温水槽(SYP-Ⅱ).

溶液的配制如下.(1)0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.20含2.0 mmol·L-1EDTA)溶液:准确称取12.114 g三羟甲基氨基甲烷和0.744 5 g乙二胺四乙酸二钠,溶于水中,用稀盐酸调pH值至8.20,定容至1 000 mL;(2) 0.01 mol·L-1HCl:准确移取10 mL 1 mol·L-1的HCl溶液稀释至1 000 mL;(3)6 mmol·L-1邻苯三酚溶液:准确称取0.189 2 g邻苯三酚,用0.01 mol·L-1HCl溶解,并定容于250 mL棕色容量瓶中,于4 ℃冰箱中保存,使用时可稀释;(4) 4 μg·mL-1SOD溶液:用微量进样器准确移取100 μL,1 mg·mL-1SOD原液于25 mL容量瓶中定容.所有溶液的配制均采用二次蒸馏水.

1.2实验原理超氧化物歧化酶是一种能催化超氧阴离子(O2·-)发生歧化反应生成H2O2和O2的金属酶,反应如下:2O2·-+ 2H+→O2+ H2O2.

在碱性条件下,邻苯三酚可在羟基H+发生离解时与溶液中的溶解氧发生反应生成半醌自由基,并产生O2-;然后半醌自由基可进一步被O2·-氧化成具有强吸收的醌,如下式所示:

如果溶液中含有SOD,则O2·-一经产生即被SOD歧化生成H2O2和O2,半醌自由基不能形成具有强吸收的醌,检测到的吸收强度将比无SOD时减弱,且减弱的程度与SOD的浓度或活性有关,依据此原理可对SOD的活性进行测定.

1.3实验方法邻苯三酚自氧化速率的测定:按照表1所示的加样量加入试管中,于25 ℃恒温水浴槽中恒温20 min后,准确移取0.30 mL 的2.5 mmol·L-1邻苯三酚(对照管用0.01 mol·L-1HCl代替),立即混匀,迅速倒入比色池中,在波长为320 nm下采用紫外-可见分光计对邻苯三酚自氧化中间产物进行时间扫描,扫描间隔为1 s,扫描5 min,记录该扫描曲线斜率即为邻苯三酚的自氧化速率ΔA0,每次测定重复2～3次,确保实验结果的准确性和重现性.

SOD活性的测定:SOD活性测定法按上述操作,加入邻苯三酚前,先加入一定量SOD,并减少同体积二次蒸馏水,其他操作均与上述相同,每次实验重复2～3次,记录该曲线的斜率即为ΔASOD.邻苯三酚自氧化的抑制率定义为:抑制率=(ΔA0-ΔASOD)/ΔA0×100%.

表1 邻苯三酚自氧化速率测定加样表

2 结果与讨论

图1 邻苯三酚自氧化产物在不同时间扫描的吸收光谱

2.1邻苯三酚自氧化中最大吸收波长的选择邻苯三酚自氧化产物在特定波长处有灵敏吸收峰,但在具体应用中,测定波长的选择存在较大差异,主要有420 nm[6]和325 nm[7].为了准确测定其最大吸收峰位置,对邻苯三酚自氧化过程在不同时间进行光谱扫描,扫描波长范围为200 ～700 nm,其结果见图1.由图可看出,在反应一开始时即在320 nm处出现了最大吸收峰,420 nm处基本无吸收峰出现.随自氧化反应的不断进行,反应中间产物不断积累,320 nm处峰的吸收强度不断增加,在30 min时峰强度有所降低,主要是由于自氧化进程在30 min时反应已基本完成.而420 nm处直到10 min时才观测到有峰出现,并且最大吸收峰的位置更准确地说应为440 nm处.文献报道的最大吸收峰为420 nm和325 nm并不准确.考虑到峰的灵敏性和准确性问题,本实验均选择在波长为320 nm处进行测定.

图2 邻苯三酚自氧化进程吸光度随时间变化关系

2.2邻苯三酚自氧化速率进程按照表1的加入量,在波长为320 nm下,对邻苯三酚自氧化过程进行时间扫描,结果如图2所示,在反应初期,吸光度随时间变化呈线性,且线性关系维持至约5 min,此后斜率渐变平缓,期间反应液由无色转变为棕黄色.为了准确表示反应初期邻苯三酚的自氧化速率,我们每次实验均选取了从30～210 s即3 min时间段内直线斜率来表示邻苯三酚的自氧化速率ΔA0.

图3 邻苯三酚浓度对其自氧化速率的影响

2.3邻苯三酚自氧化最佳浓度的确定邻苯三酚浓度可对其自氧化产物的浓度产生影响,从而影响吸收信号的强度,因此,固定其他条件不变,仅改变邻苯三酚的浓度,测定其对自氧化速率的影响,结果如图3所示.实验结果表明,随着邻苯三酚浓度的增大,自氧化速率也随着增大,两者呈线性关系,线性方程为ΔA/min-1=0.006 13+0.027 19c/mmol·L-1(R=0.999 09).结果说明邻苯三酚自氧化具有一级反应特征.由图可知,在邻苯三酚浓度为2.5 mmol·L-1时,邻苯三酚自氧化的曲线斜率约为0.06～0.07,基本满足文献[8]要求,因此在后面实验中均选用邻苯三酚的浓度为2.5 mmol·L-1.

图4 SOD的不同加入量对邻苯三酚自氧化速率的影响

2.4超氧化物歧化酶的最佳加入量的选择为了解SOD对邻苯三酚自氧化速率的影响,固定邻苯三酚的浓度为2.5 mmol·L-1不变,改变SOD的加入量,测定SOD的加入量对邻苯三酚自氧化速率的影响,实验结果如图4所示,由图可知,邻苯三酚自氧化速率与酶的加入量成反比,这与邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶的机理[9]是一致的.在碱性条件下,邻苯三酚可在羟基H+发生离解时与溶液中的溶解氧发生反应生成半醌自由基,并产生O2·-;然后半醌自由基可进一步被O2·-氧化成具有强吸收的醌,该醌在320 nm处有强吸收,但如果溶液中含有SOD,则O2·-一经产生即被SOD歧化生成H2O2和O2,半醌自由基不能形成具有强吸收的醌,因此检测到的吸收强度将比无SOD时减弱,且减弱的程度与SOD的浓度或活性有关,SOD酶活就是通过对邻苯三酚的抑制程度来测定的.因此,酶加入的越多,对邻苯三酚的抑制就越强,自氧化速率就越小.但文献[10]报道,最优的加酶量应为能抑制邻苯三酚的自氧化下降约50%为宜,此时测定的准确度和灵敏度都会比较高,据此本实验最终确定酶的加入量0.30 mL.

图5 EDTA对邻苯三酚自氧化速率的影响

2.5EDTA含量对邻苯三酚自氧化速率的影响在邻苯三酚经典自氧化方法中文献报道的缓冲溶液介质组成较混乱,有的在缓冲液中加入EDTA,但也有不加的.为了考察EDTA在邻苯三酚自氧化过程中的作用,我们配制了一系列EDTA浓度分别为0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol·L-1的Tris-HCl缓冲溶液,研究其对邻苯三酚自氧化的影响,结果如图5所示.由图5可知,EDTA加入后对邻苯三酚的自氧化进程有明显的影响,并随着EDTA加入量的增加,邻苯三酚的自氧化速率不断降低,在EDTA的浓度小于3 mmol·L-1时,EDTA对邻苯三酚的影响比较明显,而当EDTA的浓度大于3 mmol·L-1以后,对邻苯三酚的自氧化速率影响较小.据文献[9]报道,大多数金属离子对邻苯三酚自氧化速率有促进作用,尽管实验中所用水为二次去离子水,但水中仍然不可避免还会有少量的金属离子存在,当EDTA加入后,由于EDTA较强的配位能力,导致溶液中的金属离子由于被络合而失去对邻苯三酚自氧化的促进作用,加入的EDTA越多,被络合的金属离子越多,自氧化速率就越慢,而当溶液中所有的的金属离子都被络合后,再增加EDTA,因为没有了游离金属离子的存在,因此自氧化的速率便维持恒定不变.考虑到SOD酶为Cu,Zn-SOD,本身就含有金属离子,如果加入EDTA太多,有可能也会和SOD的金属离子络合,从而导致酶的失活,而加入EDTA太少,会使邻苯三酚自氧化速率过高，导致自氧化反应速率不稳定.综上分析,最终确定EDTA的加入浓度为2 mmol·L-1.

图6 不同pH值对邻苯三酚自氧化速率和SOD抑制率的影响(-自氧化速率,-抑制率)

2.6pH值对邻苯三酚自氧化速率及SOD抑制率的影响邻苯三酚在碱性条件下可发生自氧化反应,由此可知溶液的pH值在邻苯三酚自氧化中起着重要作用,控制测定体系其他条件不变,仅改变缓冲溶液的pH值进行实验.pH对邻苯三酚自氧化速率和SOD抑制率的影响如图6所示,结果表明,邻苯三酚自氧化速率随pH的升高而增大,这可能与pH值增大时邻苯三酚的酚羟基中H+更易离解,形成的带电基团能量较高、不稳定,而易被氧化有关[11].从图中也可看出,SOD抑制率随pH增加总体呈下降趋势,其中在pH值为8.00～8.40时,SOD抑制率受pH值变化的影响不明显,即在此范围内pH值的微小变化并不会引起抑制率的明显改变.在选择最适宜pH时,要考虑两方面的因素:一是要有较高的自氧化速率;二是要有明显的抑制率,文献[8]报道多采用加酶后抑制率为50%作为最适条件.因此,综合考虑诸因素的影响,本文中选择pH 8.20作为缓冲溶液适宜的pH值.

图7 不同温度对邻苯三酚自氧化速率和SOD抑制率的影响(-自氧化速率,-抑制率)

2.7温度对邻苯三酚自氧化速率及SOD抑制率的影响为了考察温度对邻苯三酚自氧化速率及SOD抑制率的影响,固定其他条件不变,分别在15、20、25、30、35 ℃的反应温度下测定温度对邻苯三酚自氧化速率和SOD抑制率的影响,结果如图7所示.

由图7可看出,温度对邻苯三酚自氧化速率和SOD抑制率总体来说影响较小,在温度从15～35 ℃范围内,自氧化速率变化范围0.052～0.058,而抑制率的变化范围11%～16%.从图7也可以看出,随温度升高,抑制率总体呈上升趋势,但考虑到在较高温度下,自由基不稳定,衰减速率加快,使测定的灵敏度和稳定性大大降低,因此本研究均采用在室温(25 ℃)下进行.

3 结论

本文中采用邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶的活性,该法具有操作简便、快速、试剂便宜且用量小,重复性好等优点;通过对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的实验条件进行详细研究,获得了测定SOD活性的最优条件为:实验温度为25 ℃,0.1 mol·L-1Tris-HCl缓冲溶液(pH值为8.20且含2.0 mmol·L-1EDTA),邻苯三酚浓度为2.5 mmol·L-1,控制酶的加入量为0.30 mL.

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