高效液相色谱串联质谱法鉴定山银花水提取液的化学成分

张湘东 宋伟峰 钟 鸣 罗淑媛

1.中药提取分离过程现代化国家工程研究中心 广州汉方现代中药研究开发有限公司，广东广州 510240；2.中山大学附属第三医院，广东广州 510630

高效液相色谱串联质谱法鉴定山银花水提取液的化学成分

张湘东1宋伟峰2钟 鸣1罗淑媛2

1.中药提取分离过程现代化国家工程研究中心 广州汉方现代中药研究开发有限公司，广东广州 510240；2.中山大学附属第三医院，广东广州 510630

目的建立快速、准确分析山银花水提取液的化学成分的高效液相色谱串联质谱方法。 方法采用水为溶剂加热回流提取法提取山银花药材，提取液采用高效液相色谱串联质谱法对其主要的化学成分进行分离和鉴定。 结果在负离子模式下，21个主要的化学成分得到了较好的分离，其中16个通过串联质谱进行了结构鉴定，10个通过对照品得到了确证。 结论 高效液相色谱串联质谱法可有效用于山银花药材的化学成分的分析鉴定。

山银花；水提取液；化学成分；高效液相色谱串联质谱法

山银花（Lonicerae Flos）为忍冬科植物灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）、红 腺忍 冬 （Lonicera hypoglauca Miq.）、华南忍冬（Lonicera confusa DC.）或黄褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa Hsuet et S.C.Cheng）的干燥花蕾或带初开的花[1]，并为《中国药典》2010年版收载，为《中国药典》2010年版金银花项下分离出来的新增品种[2]。山银花作为常用中药，具有清热解毒、凉散风热之功效，临床用于治疗痈肿疔疮、喉痹、热毒血痢、风热感冒、温热发病等[3]。近年来对其化学成分的研究表明，其主要活性成分为有机酸类、黄酮类和三萜皂苷等[4-6]。随着质谱技术的革新和液相色谱-质谱联用技术的普遍应用，液相色谱-质谱联用技术已经越来越多地应用于中药分析。与高效液相-紫外检测（HPLC-UV）比较，高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MSn）具有很高的灵敏度和选择性，并且能够提供丰富的结构信息，在中药化学成分分析鉴定中具有很大的优势。由于中药饮片主要采用水煎煮的方式服用，研究其水提取液的化学成分意义重大。本文采用水为溶剂加热回流提取山银花的活性成分，采用高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MSn）分析山银花水提液，为山银花药材的合理开发利用以及其质量控制提供实验依据。

1 仪器与试药

LCQ Fleet HPLC-MSn高效液相色谱离子阱质谱联用仪（美国 Thermo Fisher公司）；Xcalibur数据处理系统（美国Thermo Fisher公司）；色谱柱：Hypurity C18高效液相色谱柱（150 mm × 2.1 mm，5 μm，美国 Thermo Fisher公司）。 乙腈为色谱纯（美国Fisher Scientific公司），其他试剂为分析纯，水为二次蒸馏水。山银花药材购自广州采芝林药店，经制药高级工程师钟鸣鉴定为灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）。

2 方法与结果

2.1 样品提取

取山银花药材粉碎，称取10 g置圆底烧瓶中，加100 mL水，加热回流提取2 h，提取液冷却后转移至100 mL的容量瓶中，定容后过0.45 μm滤膜，待分析。

表1 山银花水提取液的化学成分分析

2.2 色谱及质谱条件

2.2.1 色谱条件 Hypurity C18高效液相色谱柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流动相 A 为 0.5%甲酸，B 为乙腈，梯度洗脱：0～5 min，98%A，2%B；6～30 min，2%～12%B；31～60 min，12%～28%B；61～80 min，28%～95%B；后运行 10 min，98%A，2%B。 流速为 0.3 mL/min，进样量为 5.0 μL，柱温为 25℃。

2.2.2 质谱条件 电喷雾（ESI）离子源，负离子检测模式；喷雾电压为 4.0 kV；鞘气（N2）流速：80 个运移单位；辅助气（N2）流速：15个运移单位；碰撞气体：氦气；毛细管温度：350℃。质谱扫描范围为m/z 50～1 000，MSn碰撞能量为40%。

2.3 成分分析

山银花药材水提取液的HPLC-MS分析总离子流色谱图见图1。由图1可知，色谱图上有21个明显的色谱峰，通过与相关文献[7]比较每个色谱峰一级质谱信息、二级质谱信息以及C18色谱柱的洗脱顺序，其中的16个化合物得到了推测鉴定，这些化合物的保留时间、一级质谱、多级质谱和分子式见表1。再通过与对照品比较保留时间、一级质谱和多级质谱信息，化合物 1、2、3、4、5、10、11、12、13 和 15 分别确证为奎宁酸、柠檬酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸C、异绿原酸A、异绿原酸B、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙。化合物6、7、8、14和16通过与相关文献比较推测为3-O-咖啡奎宁酸甲酯、断氧化马钱子苷、异槲皮苷、灰毡毛忍冬皂苷甲和灰毡毛忍冬次皂苷甲[7]。化合物9与化合物10、11、12具有相同的一级质谱信息，它们的多级质谱碎片信息也非常相似，提示它们具有相似的结构，因此推测鉴定为异绿原酸异构体。色谱图上的其他色谱峰由于缺乏相关的文献报道和对照品，结构有待进一步分析鉴定。

山银花中的咖啡奎宁酸类化合物的多级质谱裂解途径主要是咖啡酰基和奎宁酸连接的断裂，而黄酮苷和三萜皂苷类化合物的裂解规律主要是糖链的断裂，得到失去一个或多个分子糖的碎片信息，并且在多级质谱中能观察到苷元的碎片离子信息。

3 讨论

图1 山银花水提取液的总离子流图

山银花作为常用中药，资源极为丰富，同时也是多种制剂的原药材。本实验通过对山银花水提取液进行了HPLCMSn分析，研究了其水溶性的化学成分。根据各个色谱峰在质谱图中对应的准分子离子峰信息、碎片信息、质谱裂解规律和色谱保留规律，并参考相关文献，成功鉴定了16个化合物，并推测了化合物的质谱裂解机制。实验表明，HPLC-MSn技术能有效分析山银花中的有机酸类、黄酮类和三萜皂苷类成分。据文献报道，绿原酸和异绿原酸等有机酸类成分具有显著的抗病毒、调节糖脂代谢等作用[8-9]，异槲皮苷等黄酮类成分具有良好的抗炎活性，灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷等三萜皂苷具有抗肿瘤活性[10]。该三大类成分都具有非常良好的药理活性，并且可通过水提的方式提取，而中药饮片主要采用水煎煮的方式服用，因此，这三类物质共同构成了山银花的药效物质基础。本实验为山银花药材的水溶性化学成分研究、药效物质基础研究、药理药效作用研究和药材的合理开发利用提供了准确有效的理论依据。

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Identification of the major components from the water extract of Lonicerae Flos by high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

ZHANG Xiangdong1SONG Weifeng2ZHONG Ming1LUO Shuyuan2
1.National Engineering Research Center for Modernization of Extraction and Separation Process of TCM Guangzhou Hanfang Modern Medicine Research&Development Co.Ltd,Guangdong Province,Guangzhou 510240,China;2.The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangdong Province,Guangzhou 510630,China

ObjectiveTo establish a high-performance liquid chromatogranphy coupled with tandem mass spectrometry(HPLC-MSn)method for analyzing the chemical constituents from the water extract of Lonicerae Flos rapidly and accurately.MethodsLonicerae Flos was extracted by reflux extraction using water as solvent,and the extract was separated and identified by HPLC-MSn.ResultsUnder the negative-ion mode,21 major constituents were well separated,16 of them were identified by tandem mass spectrometer and 10 of them were confirmed by a comparison.ConclusionThe HPLCMSn method is useful for the rapid identification of the chemical constituents from Lonicerae Flos.

Lonicerae Flos;Water extract;Components;High-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

R927.2

A

1673-7210（2012）08（c）-0113-03

2011年国家工程研究中心创新能力建设项目。

张湘东（1971.5-），男，硕士研究生，制药工程师，主要从事中药/天然药物的研究与开发工作。

钟鸣（1973.2-），男，硕士研究生，制药高级工程师，主要从事中药/天然药物的研究与开发工作。

2012-06-19 本文编辑：卫 轲）