大鼠心肌缺血预适应延迟保护模型的制备1）

巩 婷，郭利平，姜 民，张智萃

1986年由Murry等［1］首先提出心肌缺血预适应（IP）的概念，揭示了反复短暂的缺血可使心肌在随后的较长时间缺血中得到保护，延缓心肌细胞死亡的速度，它是机体组织细胞在漫长的生物进化过程中获得的一种内在抗损伤能力。这一概念的提出，为缺血心肌的保护及其机制探讨开辟了崭新的领域。缺血预适应的保护作用表现为两个时相，即快速相和延迟相。快速相即早期保护，指缺血1次～4次，每次2min～10min的刺激，数分钟内产生保护效应，此时的保护作用是短暂的，可持续2 h～3h。延迟相指在早期IP消失24h后再度发生的保护效应，可持续24h～72h，故又称为“第二窗口”保护。虽然此期作用不如早期强，但其持续时间是早期保护作用的30倍～50倍，更具有实用意义，具有更广泛的临床应用价值。本文旨在为缺血预适应延迟保护作用的研究提供可靠模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SPF级健康成年Wistar大鼠30只，雄性，体重（220±20）g，由天津中医药大学实验动物中心提供。随机分为假手术组（S组）、心肌缺血预适应组（IP组）、缺血再灌注组（IR组），每组10只。

1.2 主要仪器和试剂 动物人工呼吸机：DH-140型（浙江医科大学医学仪器实验厂生产）；生理信号记录分析系统Biopac MP150（Biopac Systems公司，美国）；半自动生化分析仪：Microlab 300型（威图公司，荷兰）；眼科手术器械；7-0缝合细线；缝合针线；心肌酶谱试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司提供）。

1.3 药物 乌拉坦（由天津元复精细化工研究所提供）；氯化三苯基四氮唑（TTC）（Sigma公司）；青霉素；生理盐水；酒精。

1.4 模型制备

1.4.1 术前准备 适应性喂养3d，术前12h禁食，术前1h禁水。大鼠称重，20%乌拉坦（0.5mL／100g）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上。左侧胸部皮肤去毛，碘伏消毒。将针形电极插入四肢皮下，连接生理信号记录分析系统采集心电图，记录标准Ⅱ导联心电图。

1.4.2 模型制备 IP模型建立：经口腔进行气管插管，连接动物人工呼吸机，潮气量5mL／100g，呼吸频率70次／min～80次／min，呼吸比为2∶1给予呼气末持续正压呼吸。待呼吸、心率稳定后，沿胸骨左缘0.5cm第3～第5肋骨心脏搏动显著处，沿肋骨走行斜向作1.5cm切口。用止血钳钝性分离浅筋膜、深筋膜及肌肉层，充分暴露第3～第5肋骨，可见心脏暗影，用弯头止血钳在心脏搏动最明显的肋间隙打开胸腔，轻轻打开止血钳向两侧撑开胸腔，即可暴露心脏。左手轻轻挤压右侧胸腔，借助心脏跳动之势，将心脏挤出胸腔之外，左手食指、拇指及中指固定心尖，方向朝上，防止心脏搏动时缩回胸腔，充分暴露心脏，在左心耳和肺动脉圆锥间找到与左冠状动脉伴行的冠状静脉，在左心耳下方2mm处以7-0无损伤缝合针穿过心肌表层，进针深度为1.5mm，宽度为2mm～3mm，在肺动脉圆锥旁出针。然后迅速将心脏放回胸腔，轻压胸腔排出开胸后进入胸腔的气体，使胸腔形成负压，然后用直头止血钳轻轻夹闭伤口。观察心电图，待其恢复稳定10min后打开止血钳，作一活结结扎左冠状动脉前降支，将缝合线的两端留置体外备用，止血钳夹闭伤口。5min后打开止血钳，拉动缝合线两端解开活结，若细线可随意拉动说明活结完全打开，然后用止血钳夹闭伤口5 min。重复以上操作3次后逐层缝合肌肉和皮肤，将缝合线两端穿过胸腔开口处及肌层埋于皮下。逐渐减小通气量，等大鼠有自主呼吸后拔除气管插管，腹腔注射青霉素以抗炎。将大鼠由仰卧位摆至右侧卧位，注意保暖，待其苏醒。24h后逐层打开皮肤、肌层及胸腔，整理缝合线两端方向不致交叉，以可拖动为准，快速将其再作一活结结扎左冠状动脉前降支，直头止血钳夹闭伤口30min，然后松开止血钳，拉动缝合线两端解开活结，抽出缝合线，止血钳夹闭伤口再灌2h。IR模型建立：省略重复3次5min夹闭左冠状动脉前降支及5min再灌过程，其余操作同IP模型。S组大鼠冠状动脉下只穿线不结扎。

1.5 指标检测 于腹主动脉取血2mL，标本静置30min后置于离心机中离心10min（3 000r／min，4℃），取上清。采集的血清使用半自动生化分析仪测定谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平。

1.6 心肌梗死面积测定 采血后立即取出心脏，生理盐水冲洗后用滤纸吸去水分。沿冠状沟剪去心房及右心室后用电子天平称重左心室，从心尖到心室底部平行将心室切成2mm厚的薄片，将心肌置于1%TTC磷酸缓冲液（pH7.4）中，37℃水浴20 min后取出冲净滤干水分，梗死区未染色，非梗死区呈砖红色，剪下梗死区心肌以电子天平称重后按下列公式计算出心肌梗死区的百分比作为心肌梗死范围［2］。

1.7 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计学分析。实验结果以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 模型制备成功判定

2.1.1 模型成活率 IP组造模后成活9只，模型成活率为90%；IR组造模后成活9只，模型成活为90%。S组由于仅穿线不结扎，存活率为100%。IP组与IR组各死亡1只，均为结扎冠脉30min过程中死亡。

2.1.2 肉眼观察 结扎血管后血管供应范围心肌发绀或苍白，再灌注后，心肌发绀消失或减轻，苍白心肌部分恢复红色。IP组心肌发绀或苍白程度低于IR组。S组无变化。

2.1.3 心电图ST段变化情况 IP组、IR组结扎冠状动脉左前降支时均出现QRS波群增高、增宽，ST段弓背抬高；再灌注中后期QRS波群降低，ST段及T波回落，在缺血后期及再灌注期部分可出现室性期前收缩及室性心动过速，IP组明显少于IR组。假手术组心电图无明显改变。

2.2 心肌酶水平变化及心肌梗死范围比较 IP组、IR组血清心肌酶AST、LDH、CK、CK-MB显著高于S组（P＜0.05）；IP组心肌酶AST、LDH、CK、CK-MB水平低于IR组（P＜0.05）；IP组心肌梗死范围小于IR组（P＜0.05）。详见表1。

表1 各组血清心肌酶含量及梗死范围比较（x±s）

3 讨 论

随着冠心病发病率的逐年上升，心绞痛和心肌梗死已成为威胁人类健康的主要疾病。如何降低心绞痛发作的频率和程度，防止心肌梗死的发生，以及心肌梗死后如何缩小梗死面积，已经成为当今心血管疾病研究的重点。IP是心脏固有的、目前已知效果最强的心脏自我保护机制，其能够有效地对抗缺血再灌注所造成的各种心肌损伤，诱导方法多样，保护效应持久［3］。延迟保护作用因其作用时间跨度大，在临床运用时更具有可行性。因此，成功制备大鼠缺血预适应延迟保护模型为临床研究奠定了基础。本实验制备的模型具有以下优点：不需剪断大鼠肋骨，减少了动物创伤，降低了死亡率；进行心肌缺血预处理实验时需要反复3次结扎再灌冠脉，因此不可能反复多次将心脏拉到胸腔外。此模型只需将心脏从胸腔中挤出1次，操作完毕后快速将心脏回纳胸腔，整个过程控制在1min以内。并采用打活结的方法，将缝合线两端置于伤口外，便于再灌时打开活结。缺血预适应结束后将缝合线两端穿过胸腔、肌层埋于皮下，24h后逐层打开皮肤、肌层及胸腔，进行长时间缺血再灌，避免了再次将心脏挤出胸腔，此法大大降低了对心脏电生理功能的影响；经口腔进行气管插管，操作简单，减少创伤，可避免术后感染、气道塌陷、气道分泌物增多等不良状况，延长了大鼠存活时间。此造模方法能够成功制备心肌缺血预适应延迟保护模型，实用性强、成功率高。

［1］ Murry CE，Jennings RB，Reimer KA，et al.Preconditioning with ischemia：A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium［J］.Circulation，1986，74（5）：1124-1136.

［2］ 王继春，江洪.缬沙坦预处理对大鼠缺血／再灌注心肌损伤的保护作用［J］.郧阳医学院学报，2010，29（3）：224-226.

［3］ 马骏，石月萍，赵建宇.温阳通脉方预处理对心肌缺血再灌注大鼠MDA及SOD的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2008，6（6）：664-665.