超高效液相色谱串联质谱法快速测定乳及乳制品中三聚氰胺

胡强，王延云，李超豪，吴卫，向乐曦，杨春林

1(乐山市产品质量监督检验所，四川乐山，614000)2(乐山师范学院化学与生命科学学院，四川 乐山，614000)

三聚氰胺属于三嗪类含氮杂环有机化合物，是一种化工原料，广泛运用于塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电器、医药等行业。三聚氰胺含氮量高(66.6%)，因此，某些不法厂商为了降低生产成本，利用国家标准中采用凯氏定氮法只能检测含氮量并不能鉴定其化学成分的缺陷［1］，在饲料中添加三聚氰胺或直接在乳及乳制品中添加三聚氰胺，提高食品检测中蛋白质含量指标［2－4］。三聚氰胺被认为有轻微毒性，长期或反复大量摄入三聚氰胺将会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌［5］。因此，乳及乳制品中三聚氰胺检测方法的研究有着非常重要的意义。

目前，关于乳及乳制品中三聚氰胺的检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)［6］、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)［7］、高效液相色谱法(HPLC)［8－9］和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)［10－14］。由于乳及乳制品样品基质复杂，ELISA易出现假阳性，且阳性样品需进一步确证分析;GC-MS法前处理采用衍生化，操作过程繁琐;HPLC和LC-MS/MS法前处理采用固相萃取净化，试剂及耗材成本较高［15－17］。本研究选择提取液经超声波提取、液液萃取和稀释，除去蛋白质、脂肪等杂质，利用UPLC-MS/MS法，建立快速、经济、准确、灵敏的乳及乳制品中三聚氰胺的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳粉、液态乳、酸奶样品市购。

三聚氰胺(纯度99.5%)，购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈、乙酸为色谱纯，购自美国Tedia公司;0.22 μm微孔滤膜，购自美国Waters公司;二氯甲烷、乙酸铵、盐酸，均为优级纯。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UPLC I-Class+Xevo TQD超高效液相色谱串联质谱联用仪(美国Waters公司)，配有FTN自动进样器、BSM二元泵、CH-A柱温箱、ESI电离源和MassLynxTM4.1工作站;Milli-Q Academic超纯水装置(美国Millipore公司);SG5200HPT超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司);TG-20台式高速离心机(四川蜀科仪器有限公司)。

1.3 色谱分析条件

色谱条件 色谱柱:ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1 mm ×75 mm，1.7 μm);流动相为 80% 乙腈和20%水;柱温:40℃;进样量:2μL;流速0.6 mL/min。

质谱条件ESI正离子检测模式，毛细管电压3.5 kV，萃取电压3 V，离子源温度150℃，脱溶剂温度为550℃，脱溶剂气和锥孔气均为N2，脱溶剂气流速600 L/h，锥孔气流速50 L/h，碰撞气为高纯氩气，碰撞室的压力35MPa。采用多反应监测(MRM)模式，离子对驻留时间(dwell time)均为0.163 s，选择离子监测条件，见表2。

表1 MRM监测模式下的监测条件

1.4 标准溶液的配制

标准储备液:准确称取0.100 0 g(精确到0.1 mg)三聚氰胺标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇-水溶液(体积比1∶1)溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为1 mg/mL的标准储备液，于0～4℃下避光保存。

标准工作液:用基质空白溶液将三聚氰胺标准储备液逐级稀释，得到质量浓度为0.5～100 μg/L系列的标准工作液。

1.5 样品前处理

准确称取约0.5 g(精确至0.001 g)样品于15 mL具塞塑料离心管中，加入10 mL乙腈-水溶液(体积比1∶1)，涡旋30 s，然后超声提取 25 min，以8 000 r/min离心10 min，提取液转入25 mL比色管中，加入150 μL HCl(1 mol/L)和10 mL二氯甲烷，闭塞震荡20 min，然后以8 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL加入4 mL乙腈稀释，混匀后过0.22 μm滤膜，滤液供UPLC-MS/MS分析。

2 结果与分析

2.1 样品前处理的选择

乳及乳制品中主要含有蛋白质、脂肪等成分，本研究通过对选取提取液、超声波提取、液液萃取和适当稀释等前处理步骤的优化，尽可能降低基质效应、提高检测重复性和灵敏度。三聚氰胺可溶于乙腈，乙腈，而它们具有沉淀蛋白质的作用，因而提取液选择乙腈-水溶液，选取 V(乙腈)∶V(水)=8∶2、7∶3、6∶4、5∶5进行实验。结果表明，在 V(乙腈)∶V(水)=5∶5时，三聚氰胺提取效率较高，且蛋白质等杂质沉淀效果较好;超声波提取是为了增强提取液对样品中三聚氰胺的提取效率，实验发现，超声波提取时间为25 min时，三聚氰胺提取效率最高，继续延长超声波提取时间并不能提高三聚氰胺提取效率;乳与乳制品样品中至少含有3%的脂肪，使用二氯甲烷通过液液萃取除去样品中的脂肪;提取液用乙腈以1∶4倍稀释，降低浓度减少潜在干扰。

2.2 色谱条件的选择

色谱柱选择，三聚氰胺具有强极性和亲水性特点，在普通反相色谱柱上几乎无保留［18］。因此，本研究选用了ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱，该色谱柱采用1.7μm未经键合的亚乙基桥杂化颗粒，适用于保留强极性、水溶性分析物，并且适合高有机相比例分析条件，同时能有效的提高分离能力、分析速度和灵敏度［19］。从图1可以看出，采用乙腈-水体系作为流动相，在电喷雾离子源(ESI)正离子扫描模式和最佳质谱条件下，三聚氰胺的保留时间为0.51 min，定量、定性离子对分别为126.9/85.0、126.9/68.0。

图1 三聚氰胺在乙腈-水体系下分离的TIC色谱图(浓度为 2 μg/L)

流动相的选择，对于UPLC-MS/MS来说，不仅要考虑对组分的洗脱能力，而且还需考虑在质谱中是否能促使目标化合物达到较高的离子化效率。本研究分别对乙腈-水体系、GB 22388－2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》中采用的乙腈-10 m mol/L乙酸铵(用乙酸调节至 pH值3.0)体系［20］、及 Desmarchelier等［21］报道的乙腈-10 m mol/L乙酸铵体系进行比较。从图2可以看出，浓度为10 μg/L三聚氰胺标准溶液，在乙腈-水体系和乙腈-10 m mol/L乙酸铵体系下离子丰度和信噪比均无明显差异，而在乙腈-10 m mol/L乙酸铵(用乙酸调节至pH值3.0)体系下离子丰度和信噪比均低40倍左右。因此选择乙腈-水体系作为本方法的流动相。

2.3 质谱条件的选择

配制一定浓度的标准溶液，采用流动注射泵连续直接进入质谱，利用IntelliStartTM技术，质谱自动对三聚氰胺进行特异性MRM数据采集方法的开发，确定了在ESI正离子模式下，三聚氰胺的准分子离子［M+H］+为126.9，定量、定性离子对分别为126.9/85.0、126.9/68.0，及其相应的锥孔电压和碰撞能量。最后手动优化了毛细管电压、离子源温度、脱溶剂温度、脱溶剂气流速、锥孔气流速等参数，确定最佳质谱条件。

图2 三聚氰胺在不同流动相分离的TIC色谱图(浓度为 10 μg/L)

2.4 标准曲线及方法检测限

将上述配制成的质量浓度为0.5～100 μg/L系列的三聚氰胺标准工作液，在UPLC-MS/MS上进行测定，以定量离子峰面积为Y，各标准溶液质量浓度为X，得到线性回归方程为Y=372.036X－57.505 1，相关系数为0.999 1;在空白样品中逐级添加三聚氰胺标准溶液，加标浓度为5 μg/kg时，得到方法检出限(LOD，S/N=3)为 0.005 mg/kg，方法定量限(LOQ，S/N=10)为0.017 mg/kg。

2.5 方法的精密度和回收率

将3个添加不同浓度水平的液态乳、乳粉、酸奶样品按2.1方法进行样品前处理和LC-MS/MS分析。在同一条件下每个浓度水平重复测定6次，计算添加回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表2。结果表明，添加回收率为91.3% ～97.1%，相对标准偏差(RSD)小于9.03%，说明本方法是准确可靠的。

表2 三聚氰胺加标回收率和精密度结果(n=6)

3 结论

建立了快速、经济检测乳及乳制品中三聚氰胺含量的UPLC-MS/MS分析方法。乳及乳制品样品采用乙腈-水(体积比5∶5)为提取液，经超声波提取、液液萃取除去蛋白质、脂肪等杂质后，适当稀释直接进样，在1.2 min内完成样品分析。前处理省去了衍生化或固相萃取净化的繁琐操作过程，降低了试剂及耗材成本，分析阶段采用UPLC-MS/MS节约了分析时间和增强了定性的准确性。该方法检出限和定量限分别为0.005、0.017 mg/kg;不同浓度水平加标平均回收率为91.3% ～97.1%，相对标准偏差(RSD)小于9.03%。实验结果表明，该检测方法快速、经济、准确、灵敏，适合我国乳及乳制品中三聚氰胺的定性、定量检测要求。

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