鸡转移因子(信必妥)活性检测

张恒 李文鹏 吴庆海 薛喜娟 周文中 王海兵 （山东信得科技股份有限公司 山东 诸城 262200）



鸡转移因子(信必妥)活性检测

张恒 李文鹏 吴庆海 薛喜娟 周文中 王海兵 （山东信得科技股份有限公司 山东 诸城 262200）

本研究通过抗体效价提升、淋巴细胞增殖和脱E受体法三个试验验证了转移因子的部分活性。转移因子是具有免疫活性的T淋巴细胞所释放的一类带有致敏淋巴细胞的特异性免疫信息，可透析小分子物质，能够转移和扩大细胞免疫力。

转移因子 鸡 信必妥 抗体

转移因子(transfer factor)是一种不耐热、可透析的低分子肽与核苷酸复合物，具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、调节免疫功能、增强机体非特异性细胞免疫功能等作用，被誉为T细胞活性的触发剂，细胞免疫的增强剂和调节剂[1]。由于其有分子量小、无毒性、无抗原性、不引起过敏反应和不产生对抗抗体且可超越种系界限应用等优点，因而是一种具有广泛应用前景的免疫增强剂。本研究从体内和体外两个方面检测了鸡转移因子活性，为转移因子治疗疾病提供了合理解释，同时为更深一步的转移因子研究打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 SPF雏鸡购自济南斯派福禽业科技有限公司，饲养于负压隔离器中，自由采食；绵羊血采于某养殖户；猪胸腺采于诸城某屠宰场。

1.1.2 主要试剂 信必妥口服液(主要成分是鸡脾脏转移因子)产自山东信得科技有限公司。重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(H5N1，Re-5株+ Re-4株)购自辽宁益康生物股份有限公司。灭活胎牛血清及淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限公司；RPMI Medium 1640购自GIBCO公司；刀豆蛋白A(Con A)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、姬姆萨染料购自Sigma试剂公司。磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠、葡萄糖、碳酸氢钠、甲醇等生化试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 脱E受体法测定转移因子活性 （1）取新鲜猪胸腺，淋巴细胞分离液分离T淋巴细胞后，加适量Hank’s液，混匀，45℃恒温水浴保温30min(每隔5min振摇一次)。以1500r/min离心3~5min，弃上清后，再加适量Hank’s液，混匀后，置45℃恒温水浴保温30min，离心弃上清液。用Hank’s液洗涤3次，适当稀释并计数，使最终浓度为5´106个/ml。将绵羊红细胞浓度调整为5´107个/ml；转移因子(信必妥)，用Hank’s液配制成每1ml中含1mg的溶液。（2）取小试管6支，3支各加Hank’s液0.1ml作对照管，另3支各加待检样品溶液0.1ml作测定管，每管中各加脱E受体胸腺T细胞悬液0.2ml，37℃保温1h后，加绵羊红血球悬液0.2ml摇匀，以500r/min离心3min，放入4℃过夜，弃去上清液，每管中各加固定液一滴，轻轻摇匀，静置10min，加染色液2滴并摇匀，静置15min后计数，统计其中的E玫瑰花结形成的细胞数(结合3个以上绵羊红细胞)，求得结花百分率，取平均值。（3）样品活力=供试品测定管E玫瑰花结百分率-对照管E玫瑰花结百分率

1.2.2 转移因子提高禽流感油苗H5N1抗体效价 60日龄SPF雏鸡30只分为3组，试验组10只，口服转移因子(信必妥口服液)1ml/只连续饲喂2d后，每只鸡注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗1ml；对照组10只，每只鸡注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗1ml；空白组10只，不免疫不使用信必妥。免疫14d后，采取血液分离血清备用，采用HI实验测定两种毒株Re-5株和Re-4株的抗体效价。

1.2.3 转移因子提高外周血T淋巴细胞增殖 30日龄SPF雏鸡20只分为2组，试验组10只，口服转移因子(信必妥口服液)1ml/只连续饲喂2d；对照组正常饲养，不做任何处理。7d后，分离外周血，测定每一只鸡T淋巴细胞增殖率(MTT)[2]。使用SPASS统计软件，分析试验组与对照组外周血T淋巴细胞转化率差异显著性。

2 结果

2.1 转移因子的生物活性

本试验系根据转移因子可使脱E受体后的胸腺T细胞恢复其受体功能，从而反映转移因子的生物活性。实验结果见图1，最后测得样品的活性为18.2%，按T细胞活性测定法-脱E受体法测定，供试品管的E玫瑰花结百分率与对照管的E玫瑰花结百分率之差应不低于10.0%，说明转移因子具有很好的生物活性。

图1 E玫瑰花环试验结果

A：试验组(100x)；B:对照组(100x)；C：试验组(400x)

2.2 抗体效价

通过血凝抑制试验HI测定每只鸡的抗体效价，使用以下方法计算每组平均抗体效价，平均抗体效价=(Log2n1+Log2n2+Log2n3+……+Log2n10)/10，各组平均抗体效价见表1，试验组Re-4抗体效价与对照组相比高出2个滴度，Re-5抗体效价高出0.6个滴度，采用SPSS软件分析差异显著，可以看出转移因子可以显著提高疫苗的免疫效果。

表1 抗体效价测定 (log2)

注：*代表差异显著(P<0.05)

2.3 外周血T淋巴细胞增殖试验

采用SPSS软件分析MTT试验结果，试验组与对照组相比较吸光度数值差异显著，证明使用转移因子可以提高外周血T淋巴细胞活性。

表2 MTT试验数值的分析结果

注：*代表差异显著(P<0.05)。

3 讨论

转移因子作为一种免疫调节剂，其直接的作用机制目前不十分清楚，但理论已证实，转移因子能传递抗原特异性物质，作用于T细胞、巨噬细胞，介导免疫反应的发生，促进多种细胞因子在体内的生成，作用于免疫系统的多个环节，以增强受体的免疫功能。

图2 MTT实验数值柱形图

本研究从体内和体外两个方面验证了转移因子的活性。给SPF雏鸡注射后可以显著提高免疫疫苗的抗体滴度，说明转移因子可以增强体液免疫反应，增强疫苗的保护效果。淋巴细胞增殖试验结果表明转移因子可以显著促进外周血T淋巴细胞增殖；同时转移因子可以体外作用脱E受体的T淋巴细胞使其恢复结合绵羊红细胞活性，说明转移因子可以增强细胞免疫反应，增强机体的抗病毒能力。本研究结果与江青艳等人的研究一致，江青艳等[3]研究发现，鸡转移因子在提高受体细胞免疫功能的同时，还能使受体的体液免疫功能得到加强。

转移因子在家禽疾病防治中应用较广，且效果显著。对很多细菌性、病毒性、原虫性和免疫缺陷性疾病有明显而独特的疗效。临床证明转移因子在治疗鸡传染性法氏囊病、禽流感、鸡传染性法氏囊病和鸡神经型马立克氏病等疾病具有较好的治疗效果[3-6]。

因此，转移因子在治疗鸡疾病，尤其是病毒性疾病，具有很好的应用前景和发展潜力。

[1] 孙卫民, 王惠琴. 细胞因子研究方法学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2001: 762~763.

[2] 张恒. 鸡堆型艾美尔球虫免疫增强型核酸疫苗构建及其免疫效应[D]. 哈尔滨: 东北农业大学, 2011.

[3] 江青艳, 戴远威, 傅伟龙. 脾脏转移因子对粤黄鸡免疫机能的影响[J]. 畜牧兽医杂志, 1996(3): 6~8.

[4] 李学良, 刘素珍, 李炳云等. 动物转移因子的研制与临床应用[J]. 中国兽医科技, 1995(10): 22~23.

[5] 黄建文, 姜艳芬, 何维明. 转移因子对人工感染禽流感病毒雏鸡作用的研究[J]. 甘肃农业大学学报, 2002(2): 170~173.

[6] 李富桂, 张文生. 对转移因子对法氏囊病和马立克氏病的治疗实验[J]. 中国畜禽传染病, 1997(3): 55~57.

（2012–06–14）

S859.83

A

1007-1733(2012)10-0008-02