引进木霉菌株T-43对樟子松枯梢病菌的抑制效果

邓 龙 邓 勋 尹大川 宋瑞清*

(1.黑龙江省林业科学研究院，哈尔滨 150081；2.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040)

樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)是我国北方主要造林树种，在生态建设、环境修复方面发挥着重要作用。樟子松枯梢病是由松球壳菌(Sphaeropsissapinea(Fr．)Dyko et Sutton)引起的一种发生普遍、危害性大的世界性传染性病害。松枯梢病属于寄主主导性病害，对该病害的控制应以提高寄主抗性及降低病原菌种群数量为主要方向[1]。

木霉菌(Trichodermaspp.)是自然界中资源丰富的拮抗微生物，具有抗菌谱广、适应性强和多机制性的特点[2]。首先，木霉菌竞争作用强，它能迅速生长，进行营养和空间位点的竞争；它能产生挥发性或非挥发性的抗菌类物质，如木霉素、胶霉素、绿色木霉素和抗菌肽等, 对多种病原菌有抑制作用；此外还具有重寄生作用, 通过胞外酶破坏病原菌细胞壁，削弱病原菌的生长势, 甚至杀死病原菌。目前世界范围内已有以木霉菌为主要成分的生物杀菌剂，在农林业生产中发挥重要作用[3]。同时，木霉菌对植物还具有促生抗逆的作用，通过定殖和次生代谢产物促进植物生长[4]，提高其抗病能力。本研究在前期研究基础上，利用筛选获得的高效木霉菌株T-43对樟子松枯梢病菌进行室内抑菌研究，制备不同剂型菌剂进行野外应用研究，为进一步研究木霉菌对樟子松枯梢病菌的抑菌机理并开发稳定的生物菌剂打下基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

(1)木霉菌株：菌株T-43为自以色列引进的菌株，保存于东北林业大学森林微生物研究中心。

(2)病原菌株：樟子松枯梢病菌-松球壳菌(Sphaeropsissapinea)，分离自辽宁省防风固沙研究所章古台实验林场的樟子松人工林，保藏于东北林业大学林学院森林微生物研究中心。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株T-43对樟子松枯梢病菌生长的影响

(1)菌株T-43对病原菌的拮抗效果

采用平板对峙培养法[5]。用0.5cm孔径无菌打孔器分别切取PDA平板培养基上培养3d的木霉菌株和病原菌株菌饼，接种于PDA平板培养基上，间隔5cm。以单独接种病原菌株和木霉菌株的平板培养作为对照，每处理3次重复。置于25℃恒温培养箱中培养，每8h测量一次菌落半径。计算被抑制率、菌丝生长速度和相对抑制效果，对拮抗线进行观察和描述，统计竞争系数。

对峙培养中竞争系数分级标准见表1。

表1 菌株对峙培养中竞争系数分级标准

被抑制率(%)=(对照菌落直径-对峙培养菌落直径)/对照菌落直径×100%

相对抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率

(2)菌株T-43非挥发性代谢产物对病原菌的抑制效果

非挥发性代谢产物的制备：将菌株T-43接种到PDA平板培养基上活化3d，用0.5cm无菌打孔器切取菌饼3片，接种于300 mL PDA培养基中，恒温振荡培养(25℃，150r/min)7d后，用8层纱布过滤。取滤液，减压旋转蒸发浓缩到原体积的1/10，备用。

抑菌活性测定：采用生长速率法。将上述非挥发性代谢产物添加到PDA培养基中(终浓度20%)，摇匀，倒平板，待冷却凝固后，接入病原菌。以不添加代谢产物的PDA平板培养作为对照。置于25℃恒温培养5d后，采用十字交叉法测量病原菌菌落直径，计算木霉非挥发性代谢产物对病原菌生长的抑制率，每处理3次重复。

1.2.2 菌株T-43防治樟子松枯梢病的野外应用研究

试验地点：辽宁省固沙所章古台实验林场的樟子松人工林内。

野外施用时间：2010年7月10日、7月20日和7月30日，防治三次。

试验菌剂：采用孢子粉剂和液体菌剂两种。T-43孢子粉剂浓度为1.7×107个孢子/g，液体菌剂为发酵液原液。

施用方法：施用菌剂前调查所选树木的病情指数。采用树冠喷雾的方式施药。每个浓度梯度防治20株树，设3个重复，设定空白对照。

2010年9月调查病情指数，利用SPSS统计软件进行差异显著性分析。

病害损失估计采用分级计数法，以病情指数表示发病程度，病情指数计算：

病情指数=[∑(病级株数×代表数值)/株数总和×最重一级代表数值]×100

防治效果=(对照区病情指数-防治区病情指数)/对照区病情指数×100%

2 结果与分析

2.1 菌株T-43对樟子松枯梢病菌生长的影响

对峙培养48h后，菌株T-43对病原菌生长抑制率为60.17%(表2、图1)，木霉菌株生长速度快，竞争系数高，在同病原菌对峙培养中，迅速占领生态位。而病原菌在木霉抑制下几乎停止生长，并最终被木霉菌覆盖。菌株T-43与病原菌拮抗培养形成明显的拮抗线。菌株T-43对病原菌的相对抑制效果达到6以上。菌株T-43次生代谢产物中含有高效抑菌活性成分(图1)，其原液对病原菌的抑菌率为92.94%。

表2 菌株T-43与病原菌对峙培养结果

2.2 菌株T-43的野外应用研究

木霉菌剂对樟子松枯梢病具有显著的控制效果，不同浓度梯度菌剂的防治效果存在显著差异(表3)。液体菌剂(木霉次生代谢产物)防治效果高于孢子粉剂。液体菌剂10倍液对樟子松枯梢病的控制效果超过94%，随着稀释倍数的增大，防治效果逐渐降低，100倍液防治效果只有61.33%。孢子粉剂中，300倍液对病害的控制效果最好，也只有68%。

表3木霉菌株T-43菌剂防治樟子松枯梢病2010年统计结果

剂型浓度防治前/后各等级株数ⅠⅡⅢⅣ防治前/后病情指数防治效果孢子300X020/10/6033.33/43.3368.42粉剂500X040/10033.33/5052.64700X020/10/15033.33/58.3321.061000X000/15033.33/58.3321.062000X020/50/18033.33/63.335.27液体10X020/50/1033.33/3594.73菌剂20X020/20/3033.33/38.3384.2140X020/10/6033.33/43.3368.42100X090/7033.33/4561.33对照020/10/19033.33/65720/1420/1320/1

3 结论

通过木霉菌株T-43对樟子松枯梢病菌的室内外生物测定结果，得出以下结论：菌株T-43非挥发性代谢产物中含有高效抑菌活性成分，对樟子松枯梢病具有明显的控制效果。

参考文献：

[1]黄敬林，张立，高波，等.樟子松枯梢病研究进展[J].东北林业大学学报，2005,33(2):83～85.

[2]朱廷恒，邢小平，孙顺娣.木霉T97菌株对几种植物病原真菌的拮抗作用机制和温室防治试验[J].植物保护学报，2004,31(2)：139～144.

[3]Francesco V.,Krishnapillai S.,Emilio L. Trichoderma-plant-pathogen interactions[J].Soil Biology & Biochemistry,2008,(40):1～10.

[4]F. Vinale, K. Sivasithamparamb. A novel role for Trichoderma secondary metabolites in the interactions with plants[J].Physiological and Molecular Plant Pathology,2008，(72): 80～86.

[5]Morton, D.T., Stroube, N.H. Antagonistic and stimulatory eVects of microorganisms upon Sclerotium rolfsii[J].Phytopathology,1955,(45):419～420.

[6]宋漳，陈辉. 绿色木霉对土传病原真菌的体外拮抗作用[J].福建林学院学报, 2002, 22(3): 219～222.