新型齐墩果酸衍生物的合成及其抗肿瘤活性

吕广颖， 牟关敏， 杨海君

(西南科技大学 材料科学与工程学院，四川 绵阳 621010)

齐墩果酸(1)及其衍生物具有十分广泛的生物活性，如护肝降酶、抗血小板凝聚、降血脂、抗炎、抗肿瘤、抑制溃疡、抗微生物、降血糖、抗HIV等[1～3]，但由于其生物活性较弱，且生物利用度低，限制了在临床上的应用。

关于1的结构改造研究报道较多[4～8]，在一定程度上提高了1的生物活性。如1的3-位碳羰基化或17-位羧基酰胺化后所得到的衍生物具有明显的HIV抑制活性等[9,10]。A环开环的齐墩果酸衍生物具有较高的抑制前列腺NRP152和NRP154细胞生长的活性[11]。 Honda等[12]合成了一系列C环含有烯酮等结构的齐墩果酸衍生物，并发现部分化合物具有良好的抑制一氧化氮生成的活性。此外，17-位羧基转化为醛基的衍生物具有良好的癌细胞抑制作用等[13]。需要指出的是，大部分齐墩果酸衍生物都是在保持其基本结构不变的情况下，基于1的3-位羟基，12-位双键或者17-位羧基的简单转化或衍生。

Scheme1

实现1的骨架改变或者惰性甲基活化的方法，对于发现新型活性化合物，实现1向其它重要化合物的转化都具有重要的意义。如A环开环缩环，C环12-双键断裂的开环衍生物或甲基活化的齐墩果酸衍生物具有很好的生物活性[11,12]。 1的8和14-位季碳之间单键断裂的C环开环衍生物，可以进一步转化为十氢萘手性合成子，可用于合成含十氢萘结构的重要天然产物[14～17]。 14-位甲基活化的方法可用于合成一些重要的活性天然产物，如Myriceric Acid A， Myricerone等[18]。但到目前为止，还没有关于1的10-位甲基活化的研究报道，也没有10-位甲基活化的齐墩果酸衍生物以及8,14-位单键断裂的C环开环齐墩果酸衍生物的生物活性研究报道。

本文以1为原料，经过3-位羟基乙酰化，17-位羧基甲酯化，11-位碳羰基化以及光照反应，首次成功实现了1的10-位角甲基活化，合成了新型的齐墩果酸衍生物——3β-乙酰氧基-11α-羟基-11,25-环-齐墩果-12-烯-28-酸甲酯(4， Scheme 1)，其结构1H NMR，13C NMR， IR和MS表征。采用SRB法测试了1～9对N-04， Bre-04和Lu-04细胞株的体外抑制活性。结果表明，4， 8和9具有明显的抑制肿瘤细胞生长的能力。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

X-6型精密显微熔点仪(温度计未校正)；Perkin Elmer 341型自动旋光仪；Lambda 35型紫外光谱仪；Bruker Avance 600型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；Perkin Elmer Spectrum One FT-IR型红外光谱仪(KBr压片)；Bruker Daltonics Bio-TOF-QⅢ型质谱仪。

5～9参考文献[14]方法合成；其余所用试剂均为化学纯或分析纯；化合物采用一般的显色方法(如I2，磷钼酸，紫外，硫酸/乙醇)显色。

1．2 合成

(1) 3β-乙酰氧基-齐墩果-12-烯-28-酸甲酯(2)的合成

在烧瓶中加入乙醚60 mL和40%KOH溶液20 mL，搅拌下于5 ℃以下分批加入甲基亚硝基硫脲6 g；反应10 min，分出乙醚层得CH2N2乙醚溶液，用KOH干燥备用。

(2) 3β-乙酰氧基-11-氧代齐墩果-12-烯-28-酸甲酯(3)的合成

(3) 4的合成

1.3 抗肿瘤活性筛选

Sulforhodamine B(SBR)[20]在515 nm的吸光度与细胞数量呈良好的线性关系，可以作细胞数的定量。本文采用SRB法进行抗肿瘤活性筛选。

将肿瘤细胞培养在含10%小牛血清和不含酚红的RPMI 1640培养基中，内含1%青、链霉素和谷氨酰铵，在5%CO2， 37 ℃孵箱中培养。首先将肿瘤细胞按一定密度接种于96孔培养板中，24 h后换用含有不同浓度受试药物[用PBS配成1 μg·mL-1工作液，使用时按所需浓度用培养基稀释，受试药物浓度分别为(1．0×10-4， 1．0×10-5， 1．0×10-6， 1．0×10-7， 1．0×10-8) mol·L-1]的新鲜培养基，在5%CO2， 37 ℃孵箱中继续培养48 h。在每孔加入50 μL预冷50%三氯乙酸(终浓度10%)，静置5 min后放置冰箱中，于4 ℃冷藏1 h。蒸馏水洗涤5次，空气干燥，加入100 μL SRB染液(用1%醋酸配制成0.4%溶液)，在摇床上低速摇动进行染色处理细胞10 min；再用1%醋酸溶液洗涤细胞4次，在摇床上低速摇动，每次5 min，用于除去未结合染料；洗涤4次后进行空气干燥；加入150 μL 10 mmol·L-1非缓冲Tris溶液溶解结合染料，充分混匀后，经酶标仪在515 nm处测定并计算GI50。各个样品的作用强度通过GI50进行比较。一般认为有效标准为GI50<10 μmol·L-1。

2 结果与讨论

2．1 合成

参考文献[19，21]方法合成2。 2具有12-位碳碳双键，可以通过烯丙位羰基化的方法在11-位引入羰基得到3。烯丙位羰基化的方法很多，如CrO3/Py， PDC， PCC，铬酸钠/乙酸，重铬酸钠/乙酸，氟铬酸吡啶嗡盐， RuCl2(PPh3)3， Mn3O(OAc)9/tBuO2H/O2和NaClO2/tBuO2H等[22，23]。本文采用CrO3/吡啶作为烯丙位氧化试剂，以67%的产率得到11-位羰基化产物3。但该反应几倍当量的CrO3，环境污染严重，后处理十分繁琐。尝试采用KMnO4(碱性或中性)或KMnO4/KIO4(碱性或中性)等氧化剂氧化2，意外地发现该氧化剂也能实现1的11-位羰基化得到3，但产率较低(30%～40%)。 1含有7个角甲基，一般而言都是很惰性的，很难发生一般的化学反应。角甲基的活化，对于1的进一步转化、新型衍生物的制备及活性化合物发现等具有重要价值。目前，可以通过亚硝酸酯的Barton光化学反应来实现14-位甲基的活化，也可通过Na2PdCl4试剂实现4α-甲基的活化，但还没有1的10-位甲基活化的研究报道。11-位羰基的甾体化合物在光照的情况下可以实现甾体化合物10-位甲基的活化，得到甲基活化的新型甾体衍生物[23,24]。本文参照甾体甲基活化的方法，将3溶于乙醇中，在高压紫外汞灯的照射下，成功地实现了1的10-位甲基的活化，得到唯一的具有环丁醇结构的产物4。

2．2 抗肿瘤活性

为了考察1的10-位甲基活化及8,14-位单键断裂对于其生物活性的影响，对1～9进行了生物活性筛选，发现1及其简单衍生物2，3和5～7在所筛选的条件下不具有生物活性。而4,8和9有明显的抑制肿瘤细胞生长的活性(表1)。结果表明，1的10-位甲基活化及8,14-位单键断裂可提高抗肿瘤活性。这也为进一步结构活性关系研究提供了参考。

表1 抗肿瘤活性筛选结果Table 1 Results of Anti-tumor activities screening

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