儿童门静脉海绵样变性脾静脉中NF-κB、VEGF的表达及意义

毛建雄 刘磊 王斌 王建尧 罗燕 康星钰

门静脉海绵样变性(cavernous transfromation of portal vein，CTPV)是儿童比较少见的疾病，但近年来随着影像学诊断技术的进步，诊断率逐渐提高。门静脉海绵样变性患儿肝功能多无异常，主要表现为肝前性门静脉高压，消化道出血是其主要的症状及死亡原因，脾脏增大及脾功能亢进是本病的特征之一。本研究通过测定患者脾脏中NF-KB及VEGF的表达探讨CTPV患者脾脏增大的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 取2000年2月至2007年3月期间确诊门静脉海绵样变性并行分流术患者脾静脉石蜡切片7例作为实验组;对照组取车祸伤脾挫裂伤行脾切除患者脾静脉石蜡切片8例，脾切除前无脾脏方面的病变。

1.2 实验试剂 兔多抗 NF-κBp65抗体，鼠单抗 VEGF(IgG)抗体，兔超敏二步法免疫组化试剂盒，鼠超敏二步法免疫组化试剂盒，浓缩型DAB试剂盒，均购自北京中杉金桥公司。

1.3 实验仪器 石蜡切片机 LEICA RM 2135(Leica公司)，显微镜 DMLB-30(Leica公司)，显微镜成像系统(高通公司)，隔水式恒温培养箱 GNP-9160(上海精宏实验设备有限公司)，电子干燥箱 LG050B，APES载玻片(北京中杉金桥公司)，微波炉(Panasonic)。

1.4 实验方法

1.4.1 免疫组化步骤 石蜡切片脱蜡至水，PBS冲洗，浸泡于含3%H2O2去离子水10 min，将切片放入枸橼酸盐缓冲液中，微波炉内加热，使容器内液体温度达到在92℃ ～98℃之间并维持10～15 min。取出容器，室温中冷却10～20 min。PBS冲洗，滴加VEGF(或NF-κBp651:100)一抗抗体，于湿盒内4℃过夜孵育。PBS冲洗，分别滴加试剂1，室温孵育20 min，PBS冲洗，滴加试剂 2，室温孵育 20 min，PBS冲洗，用DAB显色，显微镜下控制显色时间，自来水冲洗终止显色，苏木素复染，约2 min，自来水充分洗涤，浸于1%盐酸酒精分化，自来水充分洗涤。70%、80%、90%酒精脱水;无水酒精I、无水酒精Ⅱ脱水。二甲苯I、二甲苯Ⅱ透明，中性树胶封片。

1.4.2 NF-κB及VEGF结果判定 于400倍高倍光镜下进行判定，NF-κB阳性颗粒位于细胞核或细胞浆，为棕黄色染色，VEGF阳性颗粒位于细胞浆，为棕黄色染色。

NF-kappa Bp65表达的测定:由于NF-КB活化后进入细胞核，因此单纯测量胞浆或胞核光密度不能完全代表NF-КB的活性，因此我们采取核浆光密度比值代表NF-КB的表达。每张切片随机取100个细胞，用Image Pro Plus 6.0医学图像分析软件对每个细胞的细胞核与细胞浆光密度值(OD)进行分析，计算核浆光密度比值，取均值来表示激活的NF-κB的相对表达量［1］。

VEGF表达的测定:用 Image Pro Plus 6.0医学图像分析软件分别检测每张切片的5个视野中阳性染色部位的积分光密度(IOD)值，及测量区域的面积(取出血管腔面积)，计算出平均光密度(mean density)，并取平均值来表示VEGF的相对表达量。

1.5 统计学方法 用SPSS V 17.0对数据进行统计，结果以±s表示，两组间比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NF-κB的表达 对照组阳性颗粒少，主要位于胞浆，染色较浅;实验组阳性颗粒较多，胞浆与胞核均有染色。免疫组化半定量测定实验组NF-κB的表达高于对照组，两者比较有统计学意义(P＜0.05)，表1。

2.2 VEGF的表达 阳性颗粒位于胞浆，实验组与对照组均有表达，但实验组的阳性细胞明显较对照组多，半定量测定实验组VEGF的表达高于对照组，两者比较有统计学意义(P＜0.05)，表2。

表1 实验组与对照组脾静脉NF-κB表达的对比

表2 实验组与对照组VEGF表达的对比

3 讨论

门静脉海绵样变性(cavernous transfromation of portal vein，CTPV)是指由不同病因致门静脉主干和(或)分支完全或部分阻塞或闭塞后，在其周围形成的大量的细小静脉，形成向肝性的侧支循环，表现为多腔隙的海绵样的病理改变，属于肝前型门静脉高压［2］。主要表现为门静脉高压症和继发的食管胃底静脉曲张破裂和(或)伴有门静脉高压性胃病。多有典型Banti综合征的表现:贫血、上消化道出血、脾肿大，其次为腹痛、发热。呕吐多为首发症状，患者可反复呕血和柏油便，出血量大时出现失血性休克，伴有轻到中度的脾大、脾功能亢进。门静脉海绵样变分为原发性和继发性两种，前者是由于门静脉主干和它的属支先天性发育异常所致，后者多发生于急性栓塞后［3］。目前其发病机制尚不明了，Gibson等［4］认为可能是由于门静脉海绵样血管瘤样变、胚胎发育过程中门静脉畸变，或门静脉后天性疾病如新生儿脐静脉炎、门静脉附近肿瘤、创伤等所致。

门静脉压力的升高可导致内脏器官血管发生病变，血管病变的病理改变包括内脏静脉的动脉化构形改建内脏静脉的内膜损伤以及内脏动脉壁收缩结构的破坏，如出现门静脉血管壁结构变化，脾脏增大，肠系膜血管迂曲，胃肠道淤血等。门脉高压性血管病变的发病机制可能与门脉系统的血流动力学改变、免疫反应、基因调控、血管活性物质等因素有关［5］。目前已有研究表明NF-κB参与门静脉高压血管病变的发病过程。Andrea J等［6］研究发现在门静脉部分结扎大鼠胃黏膜NF-κB 表达是增强的，Hailing Liu 等［7］认为 NF-КB 作为一种重要的转录调节因子，在门脉高压血管病变中发挥作用。

NF-κB作为一种核转录因子可以调控多种下位基因，在已发现的参与血管生成的因子中，已证明VEGF，IL-1a，IL-8，VCAM-1，TNF-α等基因中含有NF-κB的特异性结合位点，这些血管生成因子也是NF-κB的下位基因，NF-κB可以调控这些基因的表达［8］。本研究中实验组脾静脉血管壁NF-КB、VEGF的表达明显高于实验组，提示NF-КB、VEGF可能参与CTPV患儿脾脏血管改建及血管的新生，可能为门静脉高压脾脏增大及脾功亢进的发病机制之一。

近年，门静脉高压血管病变的研究逐渐深入，由于NFКB、VEGF在门静脉高压血管病变中所表现出的特异性促血管生成及血管改建作用，使其存在广泛的研究前景。通过抑制NF-КB、VEGF活性来抑制血管生成及改建，作为一种新的治疗门静脉高压的方法正在被应用于临床［9］。但由于NFКB、VEGF在CTPV发病机制尚不清楚，且NF-КB、VEGF在治疗门静脉高压的疗效尚不亲切，因此，虽然NF-КB、VEGF对治疗CTPV血管病变具有广阔的前景，但仍需要进行大量的研究。

［1］张桂林，刘善喜，邓燕，等.免疫化学染色图像分析法检测细胞核因子κB.第一军医大学学报，2003，23(5):498-500.

［2］王欣博，童中勋，刘威，等.门静脉海绵样变性外科治疗的研究进展.中国普外基础与临床杂志，2008，15(12):877-879.

［3］Gallego C，Velasco M，Marcuell P，et al.Congenital and acquired anomalies of the portal venous system.Radiographics，2002，22(1):141-159.

［4］Gibson JB，Richards RL.Cavernous transformation of the portal vein.J pathol Bacteriol，1995，70(1):81-96.

［5］祁永富，李彩英，耿左军，等.肝硬化门静脉高压症胃左静脉和脾静脉壁的NOS与VEGF表达研究.河北医药，2011，33(2):174-175.

［6］Andrea J，Moreira，Christina Fraga，et al.Quercetin prevents oxidative stress and NF-κB activation in gastric mucosa of portal hypertensiverats. Biochemical Pharmacology， 2004，68(10):1939-1946.

［7］Hailing Liu，Chau R Lo，Mark J，et al.NF-κB inhibition sensitizes hepatocytes to TNF-induced apoptosis through a sustained activation of JNK and c-Jun.Hepatology，2002，33(4):776-777.

［8］Patel S，Leal AD，Gorski DH.The homeobox gene Gax inhibits angiogenesis through inhibition of nuclear factor-kappaB-dependent endothelial cell gene expression.Cancer Res，2005，65:1414-1424.

［9］黄蔚，陈岳祥.血管内皮生长因子在肝硬化门静脉高压性胃病胃黏膜血管病变中的作用.中国全科医学，2009，12(24):2213-2216.