叶面喷施尿素对葡萄氮代谢相关基因表达的影响

初建青，王文艳，房经贵*，张春华，张彦平，宋长年

(1南京农业大学园艺学院，江苏南京210095;2江苏省农业科学院园艺研究所，江苏南京210014)

葡萄是世界性的主要水果，也是我国栽培的主要落叶果树之一。施肥是葡萄生产中重要的农事操作，葡萄施肥时间的选择往往都是根据作物的生长情况或物候期，是一种经验性的操作，难以做到指导当年精确施肥的水平。这不仅没有达到施肥的最佳效果，而且造成肥料的浪费以及由此引起的环境污染。另外，由于不同年份环境与气候等外界因素的差异，当年的调查信息用于来年的田间管理也是不够理想与科学的。传统的理论已经难以促进施肥、灌溉等重要农业技术产生质的提高。现代生物学技术的出现为人们利用基因信息指导施肥提供了可能，正如Boss等［1］早在2000年就预测在将来的20年里对葡萄基因以及基因功能的认识将加快通过基因工程手段对葡萄结果能力、果实成熟期以及植株生长习性等进行更有效调控时期的到来。葡萄全基因的测序更是为葡萄分子生物学的研究提供了重要条件［2－3］。

氮是葡萄重要的营养元素，氮素进入植物体后的代谢是一个相当重要的生理过程，它直接影响到作物的产量和品质。而硝酸盐还原酶(Nitrate reductase，NR)，亚硝酸还原酶 (Nitrite reductase，NiR)，谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)，谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase，GDH)和天冬酰胺合成酶(Asparagine synthetase，AS)等氮代谢关键酶在氮的同化过程中起着不可或缺的作用［4－7］，不同作物品种、同一种作物不同器官组织中有关酶的活性对于氮用量、施用时间等均呈现一定的反应［5，8－10］。叶面施肥对葡萄产量、品质及生理方面的作用已有诸多研究［11－14］，但尚无葡萄叶面喷肥对氮代谢循环关键酶基因表达影响的报道。根据实际生产与研究需要，本实验分离和克隆了氮代谢循环途径中上述5个关键酶对应基因(GS，GDH，AS，NR和NiR)的编码序列，对他们进行了亚细胞定位，并利用半定量RT-PCR和荧光定量PCR法研究了叶面施氮对氮代谢相关基因表达的影响，为进一步研究葡萄氮代谢机制以及提高葡萄叶面施肥效果提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试验设计 试材取自南京农业大学江浦试验基地，选用6年生藤稔葡萄(V.vinifera×V.labrusca Fujiminori)，树势良好，果园实施常规水平管理。在葡萄开花前期(5月14日)上午9时以尿素(山西丰喜华瑞煤化工有限公司生产)作为叶面肥，设置对照(喷清水)、0.3%、0.5%、0.7%(质量比)4个浓度处理，每个处理喷施5株，试验设置3次重复。分别于处理后6、24、48 h采集叶片，幼叶采自15个节位长枝条上的第12、13节位，老叶采自15个节位长枝条上的第3、4节位，－40℃ 保存备用。

1.1.2 质粒、菌株和试剂 大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α由本实验室保存。亚细胞定位载体pJIT166－GFP由南京农业大学作物遗传与育种国家重点实验室惠赠。PowerScriptTMII反转录酶购自Clontech公司，DNase酶Ⅰ、Ex Taq酶、pMD18－T simple载体、dNTP、DNA Marker、HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ和XbaⅠ购自TaKaRa公司，Trizol Reagent购自Invitrogen公司，T4 DNA连接酶购自Promega公司，DNA回收试剂盒、DL 2000 Plus DNA Marker为北京全式金生物技术有限公司生产。所用引物由上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen)合成(表1)。

1.2 试验方法

1.2.1 不同处理对葡萄品质指标的影响 于果实成熟后每株葡萄随机取5个果穗测其平均单果重(g)和平均果实大小(cm2)。其中，平均果实大小(cm2)=纵经×横经。

1.2.2 RNA的提取与纯化 葡萄叶片总RNA的提取、消化参照张彦苹［16］和 Chang［17］的方法。mRNA的纯化采用Promega公司生产的PloyATtract®mRNA Isolation System IV试剂盒进行。

1.2.3 cDNA第一链合成 以mRNA为模板，引物P01反转录合成cDNA第一条链，引物P02延伸加帽子，空气加热条件下42℃保温1 h，75℃保温10 min，冰上冷却2 min后，－70℃保存备用。

1.2.4 基因ORF及3'末端的扩增 根据不同物种间同源基因的核酸序列相对保守的特点，在Gen-Bank的核酸(nr/nt)数据库中检索拟南芥的GDH基因序列145358164，NR基因序列30681919，NiR基因序列30699283，GS基因序列186531753和AS基因序列145339205，并分别以以上序列为探针对葡萄属EST数据库进行BLAST检索，得到多条与之高度同源的葡萄 EST序列;将获得的 EST序列用DNAStar软件进行首尾拼接，获得新的Contig;以获得的 Contig反复对葡萄 EST公共数据库进行BLAST检索、拼接，尽可能获得全长cDNA［18］。以cDNA为模板分别利用氮素代谢循环途径中的5个关键酶基因GDH、NiR、NR、GS、AS的上游引物和下游引物(表1)进行PCR扩增获得各基因的ORF区，反应体系为 50 μL:cDNA 2 μL，10 pmol/μL 的引物各1 μL，10 × Ex Buffer 5 μL，2.5 mmol/L 的 dNTP Mixture 5 μL，Ex Taq 酶0.25 μL，用灭菌纯水补足到50 μL。反应参数为 94℃ 预变性 5min，94℃ 45 s、Tm 45 s、72℃1 min、35个循环，72℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检测后回收目标片段进行TA克隆，由上海博亚生物技术有限公司完成测序。

1.2.5 亚细胞定位分析 分别以表1中含酶切位点的引物(用Primer Premier 5设计能扩增包含整个ORF，但去除终止密码子)扩增GDH、NiR、NR、GS、AS基因，并克隆提取质粒，分别经HindⅢ和BamHⅠ、SalⅠ和 BamHⅠ、HindⅢ和 SalⅠ、HindⅢ和XbaⅠ、HindⅢ和XbaⅠ、HindⅢ和SalⅠ、HindⅢ和SalⅠ双酶切，用T4 DNA连接酶连接到pJIT166－GFP载体，得到 GFP/基因融合表达载体，转入DH5α，PCR、酶切筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行测序验证［19］。微粒子弹的制备和受体材料的轰击方法参照已有研究报道［19－20］。轰击后的洋葱表皮细胞25℃暗培养24 h后制片，于激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP2)下观察细胞中的荧光。将转化后的洋葱表皮用20%蔗糖进行质壁分离处理后，再分别用蓝光(395 nm)和紫外光激发成像，选用B(IF2490)激发滤光器，用PM230全自动显微照相装置拍照［19］。

1.2.6 半定量RT-PCR 为明确葡萄叶面喷施尿素对5个基因的表达的影响，利用尿素处理后老叶和幼叶的cDNA作为PCR模板，以葡萄中的UBI基因为内参，进行半定量RT-PCR，为确保半定量 RTPCR的特异性，引物设计在每个基因的3’非翻译区(3’UTR)，目的基因的引物未跨内含子(表1)。反应条件为:94℃变性3 min后进入循环，94℃变性30 s，Tm 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，共 28 个循环后，72℃终延伸5 min。UBI反应程序条件与扩增目的基因的条件相同。

1.2.7 荧光定量PCR 参照已有研究报道［18，21］，分别取2 μg RNA以P01和P02引物反转录合成cDNA，葡萄看家基因UBI为内参进行定量PCR，目的基因的引物及片段大小见表1。应用Bio-Rad My-IQ 2荧光定量PCR仪进行实时定量。RCR的反应体系按SYBR GreenⅠ(TOYOBO)说明书进行。反应程序为95℃ 10 s预变性，然后以95℃ 变性10 s、Tm退火20 s，72℃延伸30 s，进行40个循环，反应结束后分析荧光值变化曲线以及熔解曲线。试验设3次重复，试验数据采用LinRegPCR和Excel软件，进行相对定量法分析［22］，通过比较在不同组织待测基因与UBI基因表达量的比值，直观地显示出待测基因相对含量的变化。

2 结果分析

2.1 叶面喷施不同浓度尿素对葡萄单粒重、单穗重、果实大小及叶片生长情况的影响

从表2看出，0.3%、0.5%、0.7%3种不同浓度尿素水平的处理均显著提高了藤稔葡萄的单粒重，与对照相比，分别提高了49.50%、39.50%、24.70%，其中0.3%浓度尿素的处理对单粒重的影响最为明显;0.3%、0.5%、0.7%3种不同浓度尿素水平的处理均对藤稔葡萄的果实大小有一定的效果，分别比对照提高了36.4%、27.9%、26.9%，0.3%浓度尿素的处理对果实大小的影响最为明显;与对照相比，0.3%、0.5%、0.7%3种不同浓度尿素水平的处理对藤稔葡萄单穗重的影响均达到显著水平，分别提高了 85.83、79.70、39.64 g，其中0.7%浓度尿素的处理效果最不明显，说明中尿素水平有显著增大单粒重、果实大小及单穗重的作用，浓度过高反而效果不显著。

从图1看出，三个处理的叶片呈现较深的绿色，说明叶面喷施尿素有叶片生长的作用。但是，0.7%尿素处理的叶片上出现枯黄叶缘和分布规律枯黄斑点，这可能是喷施尿素浓度偏高造成的叶面烧灼。

表2 叶面喷施尿素对葡萄单粒重、果实大小及单穗重的影响Table 2 Effect of foliar applied urea on fruit biology character of fruit of Tengren grape

2.2 相关基因ORF区的克隆

以cDNA为模板分别利用GDH、NiR、NR、GS、AS 5个基因的上游引物和下游引物(未跨内含子见表1)进行PCR扩增获得各基因的ORF，得到大小与预期目标片段长度一致的相应条带(图2)。切胶回收纯化各个片段，以pMD18－T simple为载体对回收片段进行克隆。在选择培养基(含氨苄青霉素)上挑取单菌落，经PCR鉴定，获得了阳性克隆。测序的结果表明，特异扩增产物的实际大小见表1，包含上下游引物序列，将所获得序列在NCBI上登录，登录号见表1。

2.3 5个基因的亚细胞定位

细胞中蛋白质合成后需要被转运到特定的细胞器中，只有转运到正确的部位才能参与细胞的各种生命活动［23］。为进一步认识所克隆的GDH、NiR、NR、GS、AS基因表达的蛋白在细胞中发挥功能的具体部位，本研究对其进行了亚细胞定位分析(图3)。本试验在绿色荧光蛋白与基因的融合基因表达载体构建完成后，对载体目标区域的测序结果表明融合基因载体构建正确［19］，之后利用基因枪法将绿色荧光蛋白(GFP)基因转化到洋葱表皮细胞中，获得高效瞬时表达，绿色荧光蛋白在475 nm蓝光激发下产生509 nm的绿色荧光。对照GFP蛋白无核定位功能，可经过核孔复合物扩散进入细胞核，从而在细胞核内和细胞质中都可以观察到清晰的GFP的绿色荧光信号(图3F)。本研究将 GDH、NiR、NR、GS、AS基因插入到35S启动子和绿色荧光蛋白基因之间形成GDH-GFP、NiR-GFP、NR-GFP、GSGFP、AS-GFP融合蛋白，其中GDH-GFP在线粒体内产生绿色荧光(图3A)，NR-GFP在细胞膜和细胞质内产生绿色荧光(图3B)，AS-GFP在细胞质内产生绿色荧光(图3C)，而 NiR-GFP(图3D)和 GS-GFP(图3-E)在细胞内未产生绿色荧光，这可能是由于NiR-GFP和GS-GFP未表达，也有可能NiR-GFP和GS-GFP具有在叶绿体内表达的特点而无法在没有叶绿体的洋葱细胞内产生信号，故检测不到定位信息。

2.4 相关基因的时空表达分析

2.4.1 基因特异引物的PCR验证 为避免qRTPCR结果的假阳性的影响，本研究分别利用5个基因的上、下游引物(表1)分别对部分取样时期来源底物cDNA进行PCR扩增，特异扩增产物回收、克隆、测序得到与预期PCR产物相符，并且RNA提取和消化过程严格地消除了DNA污染，说明引物设计和反应模板质量均符合半定量RT-PCR、荧光定量PCR的实验要求，不存在假阳性现象。

图3 GDH、NR、AS、NiR、GS基因在洋葱表皮细胞中的定位Fig.3 Subcellular localization of GDH，NR，AS，NiR，GS-GFP fusion protein in onion epidermal cells

2.4.2 叶面喷施不同浓度尿素对葡萄硝酸还原酶基因表达的影响 硝酸还原酶(NR)是植物氮代谢的限速酶，其基因表达高低控制着整个同化过程，且反映了蛋白质合成和氮代谢的活性。NR活性受到很多环境因子调节，如氮源、光、O2/CO2、pH和温度，还有些内在因素如代谢物和植物激素。结果表明，葡萄硝酸还原酶基因(NR)的表达水平随着叶面喷施尿素浓度的不同而表现出明显的差异，在同一时间段下，表达水平在0.3%和0.5%浓度的处理下显著高于CK和0.7%浓度的处理(图4)，说明中尿素浓度有利于NR的表达，而高尿素浓度不利于NR的表达;葡萄老叶NR在0.5%浓度的处理下表达水平显著，幼叶NR在0.3%浓度的处理下表达水平显著，说明葡萄老叶以喷施0.5%浓度的尿素对NR的表达水平影响显著，幼叶以喷施0.3%浓度的尿素对NR的表达水平影响显著。在同一浓度尿素水平下，NR在不同时间段的表达水平差异不一致:葡萄老叶NR在处理后48 h的表达水平显著高于6 h和24 h，幼叶NR在处理后6 h的表达水平显著高于24 h和48 h，说明葡萄幼叶NR对叶面喷施尿素的响应要早于老叶。在同一浓度尿素水平和同一时间段下，NR在葡萄幼叶中的表达水平显著高于老叶，说明叶面喷施尿素以喷布到幼叶对NR的表达水平影响显著。NR在葡萄叶片喷施尿素后直至48 h一直保持着比较高的表达水平，因此其可以作为葡萄叶片喷施尿素中后期的氮代谢信号途径的标记基因。

图4 叶面喷施尿素对葡萄硝酸还原酶(NR)基因表达的影响Fig.4 Effect of foliar applied urea on expression of genes encoding nitrate reductase(NR)in grape leaves

2.4.3 叶面喷施不同浓度尿素对葡萄亚硝酸还原酶基因表达的影响 葡萄亚硝酸还原酶(NiR)是硝酸盐同化途径中第二个发挥作用的酶，反应涉及从降解的铁氧还蛋白向亚硝酸盐转移6个电子，使之形成铵。图5看出，在同一时间段下，NiR的表达水平在0.3%和0.5%浓度的处理下显著高于CK和0.7%浓度的处理;在同一浓度尿素水平和同一时间段下，葡萄幼叶NiR的表达水平显著高于老叶;在同一浓度尿素水平下，NiR在不同时间段的表达水平差异不一致:葡萄老叶NiR在处理后24 h的表达水平显著高于6 h和24 h，幼叶NiR在处理后6 h的表达水平显著高于24 h和48 h。与NR表达水平相比(图4)，NiR在各个浓度水平和各个时间段下的表达水平均低于NR，说明葡萄叶面喷施尿素后NiR对信号的响应效果不如NR显著，可能是由于NiR位于NR催化反应的下游，对信号的响应比较置后。

2.4.4 叶面喷施不同浓度尿素对葡萄谷氨酰胺合成酶基因表达的影响 葡萄谷氨酰胺合成酶(GS)是处于氮代谢中心的多功能酶，催化无机氮转变成有机氮的第一步反应，其基因表达的高低可以反映氮素同化能力的强弱。图6看出，在同一浓度尿素水平下，GS各个时间段的表达水平在老叶和幼叶之间存在显著差异，幼叶GS的表达水平明显高于老叶;NR在不同时间段的表达水平差异亦不一致:葡萄老叶NR和幼叶NR均在处理后6 h的表达水平显著高于24 h和48 h。在各个时间段下，GS的表达水平均在0.3%和0.5%浓度的处理下显著高于CK和0.7%浓度的处理。葡萄叶片喷施尿素后6 h时GS的表达量上升明显，其表达水平明显要高于其他基因，因此GS基因可以作为葡萄叶片喷施尿素前期的氮代谢信号途径的标记基因。

2.4.5 叶面喷施不同浓度尿素对葡萄天冬酰胺合成酶基因表达的影响 Nakano等［24］通过Northern杂交分析表明天冬酰胺合成酶基因(AS)在同一水稻植株不同组织中的表达水平不同，在同一组织不同发育时期的表达水平也不同。图7看出，在同一浓度尿素水平和同一时间段下，葡萄AS在幼叶中的表达水平明显高于老叶，说明喷施尿素以喷布到幼叶对AS的表达影响显著。在同一浓度尿素水平下，AS在不同时间段的表达水平差异不一致:葡萄老叶NR在处理后48 h的表达水平显著高于6 h和24 h，幼叶NR在处理后6 h的表达水平显著高于24 h和48 h。AS的表达水平随着叶面喷施尿素浓度的不同而表现出明显的差异，在同一时间段下，老叶AS表达水平趋势为U0.3% ＞U0.5% ＞U0.7% ＞CK，幼叶AS表达水平趋势为U0.5%＞U0.3%＞U0.7%＞CK，但幼叶AS在6h的表达水平CK＞0.7%，这可能由于不同采样时间以及采样时的光照、气温、湿度等环境因素的影响而导致的表达趋势不一致。与GS表达水平相比(图6)，AS在各个浓度水平和各个时间段下的表达水平均低于GS，说明葡萄叶面喷施尿素后AS对信号的响应效果不如GS显著，可能是由于AS位于GS催化反应的下游，对信号的响应比较滞后。

图7 叶面喷施尿素对葡萄天冬酰胺合成酶(AS)基因表达的影响Fig.7 Effect of foliar applied urea on expression of genes encoding asparagine synthetase(AS)in grape leaves

2.4.6 叶面喷施不同浓度尿素对葡萄谷氨酸脱氢酶基因表达的影响 谷氨酸脱氢酶(GDH)一般参与氨基酸降解的氧化脱氧作用，在植物生育期内，GDH在氨的再同化中起重要作用，尤其是在果实发育后期对于催化形成谷氨酸具有重要作用。试验结果(图8)表明，喷施尿素的浓度不同，基因的表达水平存在一定差异，在同一时间段下以0.3%和0.5%浓度的处理对谷氨酸脱氢酶基因(GDH)表达的影响更为明显，说明叶面喷施中浓度尿素更能够诱导氮代谢循环中的GDH发挥作用。GDH的表达水平在0.7%浓度的处理下不如0.3%和0.5%浓度的处理显著，可能是由于浓度过高对葡萄生长造成不利的影响。通过比较喷施同一浓度尿素后同一时间段葡萄老叶和幼叶中GDH的表达水平看出，幼叶GDH的表达水平总体上比老叶中的大，说明叶面喷施尿素以喷布到幼叶或新稍对葡萄GDH的表达水平影响更大。GDH在不同时间段的表达水平差异不一致，葡萄老叶中GDH的表达水平在叶面喷施尿素后48 h达到最高，老叶中GDH的表达水平在叶面喷施尿素后6 h达到最高。

3 讨论

图8 叶面喷施尿素对葡萄谷氨酸脱氢酶(GDH)基因表达的影响Fig.8 Effect of foliar applied urea on expression of genes encoding glutamate dehydrogenase(GDH)in grape leaves

氮是植物的重要成分，对植物生长有着重要的作用。特别是叶片氮含量与光合作用之间有着高度正相关关系［25－26］。有关氮肥施用量对植物生长及产量的影响已有许多报道［27－34］。本试验中葡萄叶片的颜色随着叶面喷施尿素浓度的增加而呈增深的趋势(图1)，说明葡萄叶面喷施尿素有利于叶片生长。杨阳等［35］的研究成果表明，所有喷氮处理均有利于提高葡萄果实的单粒重。单一叶面肥或不同组合的叶面肥均显著提高了葡萄的单穗重，使果粒明显增大，最终提高了葡萄的产量，增产率高达12.75% ～24.57%［36］。叶面喷施尿素后，藤稔葡萄的单粒重和果实大小明显高于对照(表2)，说明叶面喷施尿素有利于提高葡萄果实的单粒重和果实大小。

大量的研究显示，由于半定量RT-PCR与荧光定量PCR两者的基本原理的一致性，两者的结果存在高度一致性［18，21］。本研究采用半定量 RT-PCR与荧光定量PCR方法对葡萄5个氮代谢相关重要基因表达特性的研究表明，两者的结果一致性比较高，说明了所利用的RT-PCR反应体系稳定与可靠。本实验通过喷施尿素后老叶和幼叶的基因表达情况比较得出，幼叶中同一浓度各个时间段的基因变化总体上比老叶中的大，可能是吸收的尿素优先分配到新梢和嫩叶等新生器官中，而向下仅有少量的运输，说明叶面喷施尿素以喷布到幼叶或新稍对基因表达的影响效果更佳，这与孙培琪［8］在樱桃上的研究结果是一致的。喷施尿素后48 h时，幼叶中各个基因的表达水平明显高于老叶，说明了幼叶中肥效的持续时间可能要长于老叶。本研究喷施不同浓度尿素后基因的表达量总体上比对照有明显变化，其中0.3%和0.5%浓度处理的效果比0.7%浓度处理的效果显著，说明叶面适量喷施尿素可以诱导氮代谢循环中的关键酶发挥作用，并对氮同化有显著效果;而0.3%和0.5%浓度的尿素对藤稔葡萄单粒重、单穗重、果实大小以及叶片生长情况比0.7%浓度处理的效果显著(表1)，显然喷施不同浓度尿素后基因的响应情况与果实的生长情况同步增长，说明了0.3%和0.5%浓度的尿素适宜于葡萄叶面喷施。

不同植物达到稳定吸收速率的诱导时间不同。小麦的最大吸收能力是在诱导10 h后达到，而玉米6 h，大麦 12 ～24 h［37］，不同植物关闭这一诱导系统所需的时间也不相同。从图4～图8可以看出，本研究中通过半定量RT-PCR与荧光定量PCR检测喷施尿素后叶片中基因的表达情况，6 h时5个基因的表达量均高于对照，说明叶片在喷施尿素后6 h时已经开始活跃的氮同化代谢，氮素代谢循环中的关键酶已经发挥作用，直至48 h时5个基因的表达量仍高于对照，说明此时相关代谢仍比较活跃，也说明了叶面喷施尿素的肥效至少可以持续48 h。而对于喷施尿素后各个基因在6、24和48 h的表达水平出现一定的不一致性，可能是由于光照、气温、湿度等环境因素影响了酶的活性以致表达量出现一定的非规律差异，但具体的原因还需进一步研究。

胞质中的尿素经脲酶水解为氨，进而在谷氨酰胺合成酶(GS)的作用下进入氮同化途径，而外源氮源如尿素也可以诱导另一条调控途径促进NR基因及NiR基因的转录水平提高［38－39］。从本实验的表达分析结果可知叶面喷施尿素后GS以及其下游基因AS和GDH的表达量均比对照有明显增高。虽然GS的上游基因NR及NiR的表达量也有增高的趋势，但它们的表达量在叶面喷施尿素后6 h低于GS、AS，说明叶面喷施尿素可能诱导了另一条调控途径，从而促进了NR及NiR的表达，但此调控途径对信号的响应效果不如在谷氨酰胺合成酶(GS)的作用下进入氮同化的途径明显。NR、GS在各个阶段的表达水平分别高于NiR、AS，说明葡萄叶面喷施尿素后NR、GS对信号的响应效果分别比NiR、AS显著，可能是因为氮代谢循环途径中NR、GS分别位于NiR、AS催化反应的上游，对信号的响应比较早。

Wan等［40］的研究表明，AS1表达的水平可以作为大豆育种中筛选高(或低)蛋白质含量种质的一个标记。氮代谢关键酶调控基因也具有信号途径标记基因的特点，对于分析不同植物氮代谢信号途径具有重要帮助。本实验的表达分析结果看出，葡萄叶片喷施尿素后6 h时GS的表达量上升明显，其表达水平明显要高于其他基因，因此GS基因可以作为葡萄叶片喷施尿素前期的氮代谢信号途径的标记基因。许多研究表明，硝酸还原酶是高等植物氮素同化的限速酶［41］，也是一种诱导酶［42］，而 NR 基因在葡萄叶片喷施尿素后直至48 h一直保持着比较高的表达水平，与前人研究结果相一致［39］，因此其可以作为葡萄叶片喷施尿素中后期的氮代谢信号途径的标记基因。

4 结论

统计分析结果表明，中尿素水平的叶面喷肥有显著增大藤稔葡萄单粒重、果实大小及单穗重的作用，浓度过高反而效果不显著。对葡萄5个氮代谢相关基因的亚细胞定位及表达情况的研究结果表明，GDH-GFP定位于线粒体，NR-GFP定位于细胞膜和细胞质，AS-GFP定位于细胞质，而 NiR-GFP和GS-GFP在细胞内未产生绿色荧光。5个基因在葡萄幼叶中的表达水平显著高于老叶;在不同时间段的表达水平差异不一致，但表达水平均高于对照，其中以0.3%和0.5%浓度处理的效果最明显。喷施尿素后6 h，GS的表达量上升幅度明显高于其它基因，而NR在喷施尿素后48 h内一直保持着比较高的表达水平;NiR、AS表达量的变化趋势分别与NR、GS相一致，并且NR＞NiR，GS＞AS。

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