野胡萝卜花挥发油成分分析及生物活性研究

李 美 邵邻相 徐玲玲 成文召 高海涛 丁 晴

(浙江师范大学化学与生命科学学院，金华 321004)

野胡萝卜花挥发油成分分析及生物活性研究

李 美 邵邻相 徐玲玲 成文召 高海涛 丁 晴

(浙江师范大学化学与生命科学学院，金华 321004)

分析野胡萝卜花挥发油的成分及检测其生物活性。采用GC/MS分析野胡萝卜花挥发油的成分，比浊法检测细菌活性，MTT法检测细胞活力。从野胡萝卜花挥发油中鉴定出31种化合物，以β－红没药烯为主要成分，占到63.06%。高质量浓度(30 g/L)的野胡萝卜花挥发油作用鲍曼不动杆菌24 h的抑制率为33.12%。野胡萝卜花挥发油作用人肝癌 HuH7 细胞 6、12、24 h 的 IC50分别是 122.99、132.25、46.20 mg/L，作用人肺癌 NCI－H446 细胞6、12、24 h 的 IC50是244.82、113.13、61.76 mg/L。野胡萝卜花挥发油主要成分是 β －红没药烯等萜类化合物，具有抗菌抑癌的作用。

野胡萝卜 挥发油 GC/MS 抑菌活性 抑癌活性

近年来，植物挥发油因具有多种生物活性［1－4］而备受关注。野胡萝卜(Daucus carota Linn.)，又名鹤虱草，山萝卜，在我国各省均有分布。据文献报道，野胡萝卜挥发油具有改善认知功能障碍［5］、毒杀蚊幼虫［6］、抑菌［7］的作用。Staniszewska 等［8］研究表明枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌对野胡萝卜挥发油敏感，而铜绿假单胞菌、扩展青霉菌则不敏感。Rossi等［9］研究表明野胡萝卜挥发油对空肠弯曲菌的生长有抑制作用，甲基异丁香酚和榄香烯是其主要抑菌成分。除此之外，野胡萝卜挥发油还有抗肿瘤活性，Zeinab等［10］研究表明其能抑制药物诱发的小鼠皮肤乳头状瘤生长。但有关野胡萝卜挥发油体外抑制癌细胞作用方面的研究鲜见报道。本试验旨在分析野胡萝卜花挥发油化学成分，研究其对体外菌株和癌细胞增殖的影响，为野胡萝卜的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲍曼不动杆菌:浙江金华市中心医院;人肺癌NCI－H446和肝癌HuH7细胞:中国科学院上海细胞生物研究所;新生牛血清:杭州四季青生物工程有限公司;DMEM培养基、RPMI1640培养基、胰蛋白酶:Gibco公司;吐温－80、二甲基四氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO):Sigma公司。

QP5050A型气相色谱－质谱联用仪:日本岛津公司;3111型CO2细胞培养箱、1500型全自动酶联免疫检测仪:美国热电公司。

1.2 试验方法

1.2.1 野胡萝卜花挥发油的提取

取野生的野胡萝卜花晾干、粉碎后，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，无水硫酸钠干燥，过滤灭菌后，以吐温－80为助溶剂采用文献［11］的方法配成母液放于4℃冰箱保存备用。

1.2.2 GC/MS 分析条件

色谱柱:VF－Wax石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm);初始温度:60 ℃(保持2 min)升至250℃(保持10 min);升温速度:15℃/min;汽化温度:230℃;载气(流量):He(1.0 mL/min);分流比:200∶1;进样量:1.0 μL。

质谱检测器:EI电离源、源温200℃、电离电压70 eV;质谱标准库:NIST库。

1.2.3 比浊法测定挥发油的抗菌活性

96孔板每孔接种浓度为2×103个/mL菌液100 μL，然后加入不同浓度的挥发油溶液100 μL，使其质量浓度分别为0、10、15、30 g/L。置于37℃恒温培养箱中培养24 h后，酶标仪600 nm下测定OD值。以仅加培养基的孔调零，并设置溶剂吐温－80组，每组设4个平行孔，按下式计算抑菌率。抑菌率=(吐温－80组OD值－试验组OD值)/吐温－80组OD值×100%。

1.2.4 MTT检测挥发油对癌细胞增殖的影响

取对数生长期的细胞，以1×105个/mL的浓度，每孔90 μL接种到96孔板中。接种12 h后，再加入90 μL 挥发油溶液，使其质量浓度分别为0、12.5、25、50、100、200、400 mg/L。分别继续培养 6、12、24 h后，加入5 mg/mL的MTT 20 μL。待反应4 h后，吸弃培养基，每孔加150 μL DMSO，避光振荡15 min，至结晶完全溶解。酶标仪在570 nm波长下测定OD值。以加等体积培养基处理的孔调零，并设置溶剂吐温－80组，每组设6个平行孔，按下式计算抑制率。肿瘤细胞生长抑制率=(吐温－80组OD值－试验组OD值)/吐温－80组OD值×100%。1.2.5 统计方法

使用 Microsoft Excel和 SPSS12.0统计软件分析，结果以珋x±s表示。

2 结果与分析

2.1 野胡萝卜花挥发油成分分析结果

野胡萝卜花挥发油经GC/MS分析得到总离子流图，如图1所示。结果共检出31种成分，主要为萜类化合物，占总峰面积的的99.97%。其中共分离得到倍半萜及其衍生物14种，占总挥发油的80.88%;单萜及其衍生物共14种，占4.85%;除此之外的3种化合物占14.24%。从表1中可以看出野胡萝卜花挥发油的主要化学成分为萜烯类化合物，含量最高的是β－红没药烯(β－Bisabolene)，其质量分数为63.06%。其次是13.65%的 α－细辛脑(α－Asarone)，5.71%的4(14)，11 － 桉叶二烯(Eudesma－4(14)，11 － diene)，5.26% 的 Z，Z，Z －1，5，9，9 － 四甲基 －1，4，7，－ 环十一(1，4，7 － Cycloundecatriene，1，5，9，9 － tetramethyl－ ，Z，Z，Z － )，2.55%的 1R －α－蒎烯(1R－α－pinene)，2.21%的胡萝卜次醇(Carotol)。石竹烯(Caryophyllene)和β－倍半水芹烯(β－Sesquiphellandrene)的质量分数也在1%以上。

图1 野胡萝卜花挥发油化学成分总离子流图

表1 野胡萝卜花挥发油化学成分及相对含量

2.2 野胡萝卜花挥发油对鲍曼不动杆菌增殖的影响

野胡萝卜花挥发油对鲍曼不动杆菌增殖的影响见表2。与正常对照组相比，试验组与吐温－80组的OD值均显著减小(P＜0.05)。所以计算抑菌率时，以吐温－80组为对照。与吐温－80组相比，30 g/L野胡萝卜花挥发油组OD值显著减小(P＜0.05)。经计算，质量浓度为 10，15，30 g/L 的野胡萝卜花挥发油作用鲍曼不动杆菌24 h后，抑制率分别为 1.85%，12.10%，33.12%。可以看出，浓度低的野胡萝卜花挥发油对鲍曼不动杆菌的增殖无影响，浓度高时可以抑制其增殖。

表2 野胡萝卜花挥发油对鲍曼不动杆菌增殖的影响(珋x±s，n=4)

2.3 野胡萝卜花挥发油对癌细胞活力的影响

如图2所示，野胡萝卜花挥发油质量浓度为12.5，25，50，100，200，400 mg/L 时，其作用人肺癌HuH7细胞 12 h后的抑制率分别为 24.35%，23.67%，31.06%，52.42%，76.09%，93.82%。100 mg/L的挥发油作用HuH7细胞6，12，24 h后的抑制率为48.48%，52.42%，97.13%。随着浓度的增大和作用时间的延长，抑制率均增大。

图2 野胡萝卜花挥发油对人肝癌HuH7细胞增殖的抑制作用

从图3可以看出，野胡萝卜花挥发油作用NCIH446细胞时，表现出同样的规律。野胡萝卜花挥发油作用人肝癌HuH7细胞6、12、24 h的 IC50分别是122.99、132.25、46.20 mg/L，其作用人肺癌 NCI －H446 细胞 6、12、24 h 的 IC50分别是 244.82、113.13、61.76 mg/L。

图3 野胡萝卜花挥发油对人肺癌NCI－H446细胞增殖的抑制作用

结果表明，野胡萝卜花挥发油能够抑制人肺癌NCI－H446和肝癌HuH7癌细胞的增殖，并表现出一定的时间和浓度依赖性。

3 讨论与结论

野胡萝卜花挥发油的主要成分为β－红没药烯、α －细辛脑、4(14)，11 － 桉叶二烯、Z，Z，Z －1，5，9，9－四甲基－1，4，7，－环十一碳三烯、蒎烯、胡萝卜次醇、石竹烯，其中4(14)，11 － 桉叶二烯和 Z，Z，Z－1，5，9，9 －四甲基 －1，4，7，－ 环十一碳三烯尚属野胡萝卜挥发油中首次报道。文献报道的野胡萝卜挥发油的主要成分榄香烯、芹子烯、大根香叶烯，未在样品中检出［9，12－13］。野胡萝卜花挥发油中含量最高是β－红没药烯，与湖北产的南鹤虱挥发油相似［12］。样品的产地、采收季节及贮藏条件的不同，或测试条件的不同，可能造成野胡萝卜挥发油的主要成分存在上述差异。野胡萝卜花挥发油中的α－细辛脑具有降血脂、利胆、止咳的功效［14］，蒎烯具有抑菌的活性［15］。

抑菌试验表明，低浓度野胡萝卜花挥发油对鲍曼不动杆菌增殖的影响不明显，当质量浓度大于15 g/L时表现出抑菌作用。野胡萝卜花挥发油质量浓度大于200 mg/L时对HuH7和NCI－H446细胞的抑制率均大于50%，表现出较强的抑癌活性。挥发油作为典型的亲脂性物质，可以破坏细胞膜，引发膜内一系列的改变，影响细菌、细胞正常的增殖，表现出一定的抗菌抑癌活性。

野胡萝卜花挥发油的主要成分是萜类化合物，具有抗菌抑癌的作用。本试验为野胡萝卜的开发利用以及野胡萝卜挥发油的临床应用提供了一定的科学依据。

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Study on Constituents and Biological Activity of Volatile Oil from Umbels of Daucus Carota Linn

Li Mei Shao Linxiang Xu Lingling Cheng Wenzhao Gao Haitao Ding Qing
(College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004)

To analyse constituents and determine the biological activity of the volatile oil from umbels of daucus carota linn.，chemical constituents was analyzed by GC/MS，the vitality of bacteria was assayed with nephelometry method and the vitality of cancer cell was evaluated by MTT assay.31 compositions were identified and the mian compound was β － bisabolene accounting for 63.06%of the total oil.The inhibition rate of the oil against acinetobacter baumanii for 24 h was 33.12%at high concentration of 30 g/L.The IC50of the oil on hepatocellular carcinoma HuH7 cells for 6，12，24 h were 122.99，132.25，46.20 mg/L and the IC50on human lung cancer cell line NCI－ H446 were 244.82，113.13，61.76 mg/L.The mian constituents of volatile oil from umbels of daucus carota linn.were terpenes such as β － bisabolene and the oil had antibacterial and anticancer activities.

daucus carota linn，volatile oil，GC/MS，antibacterial activity，anticancer activity

Q949.95

A

1003－0174(2012)09－0112－04

2011－12－12

李美，女，1985年出生，硕士，细胞生物学

邵邻相，男，1962年出生，教授，硕士生导师，细胞生物学