响应面法优化米渣发泡蛋白制备工艺的研究

吴雨静 杜先锋

(安徽农业大学茶与食品科技学院，合肥 230036)

响应面法优化米渣发泡蛋白制备工艺的研究

吴雨静 杜先锋

(安徽农业大学茶与食品科技学院，合肥 230036)

米渣经脱糖，酶解，脱色，喷雾干燥制得乳黄色，无异味，蛋白含量高，发泡性能良好的蛋白发泡粉。在单因素试验的基础上，选择对发泡力影响较大的3个因素(加酶量，酶解时间，料液比)进行响应面试验，通过SAS软件分析，对中性蛋白酶酶解米渣的条件进行优化。并通过高效液相凝胶色谱和扫描电镜从微观层面解释了发泡粉发泡性能增加的机理。结果表明，最佳酶解条件为:加酶量1.33%，酶解时间2.16 h，料液比1∶10。理论预测最大发泡力为277 mL，经验证，酶解液最大发泡力为275 mL。

米渣 酶解 中性蛋白酶 发泡粉

米渣是淀粉糖生产过程中的副产品，即以大米为原料，经淀粉酶高温液化处理并经板框压滤除去糖类物质而得到的残渣，其蛋白质质量分数约为40%～60%［1］。大米蛋白作为优质的谷物蛋白［2］，非常适宜用来开发蛋白发泡粉。但由于高温作用，米渣中的蛋白质通过二硫键连接成了高分子聚集体［3］，相对分子质量增大，并含有较多的疏水性氨基酸，从而变性米渣蛋白的溶解性很差，因此相应的物化功能的应用也受到限制。目前大多是采用蛋白酶对米渣蛋白进行水解，使其释放出更多的—COOH和—NH2，从而增大蛋白质分子的极性，促使蛋白质的溶解性得到增加，同时其溶液的胶体性质也得到增强，从而表现出一定的乳化和发泡性能［4］。

目前国内研究较多的是大豆蛋白的酶法水解［5－7］，而关于酶法水解大米蛋白制取食用发泡粉的研究报道只有少数。阮晖等［8］用碱性蛋白酶对大米浓缩蛋白进行改性，获得了发泡力为162%的发泡蛋白。胡中泽［9］采用胃蛋白酶对早籼米进行水解，获得了发泡性能良好的发泡粉。

良好的发泡性不仅需要增加蛋白质的溶解性，而且也需要提高其疏水性，使亲水和疏水达到良好的平衡［10］。不同的蛋白酶具有不同的酶切位点，其修饰后的蛋白质的结构变化也不相同，暴露的疏水基团的多少也不相同。由于蛋白质分子表面暴露的疏水性氨基酸越多，蛋白质的发泡性就越强［11］，所以可以选择作用位点为芳香族疏水性氨基酸羧基端的中性蛋白酶［12］对米渣蛋白进行水解，对含有疏水性氨基酸的肽键进行裂解，如 His－Leu，Ala－Phe，Gly－Phe，提高溶解性的同时也增加了疏水性氨基酸的暴露，改善发泡性能，从而可以制备蛋白发泡粉。夏建秋等［6］将中性蛋白酶用于大豆蛋白发泡粉的生产，工艺成熟，产品质量优良，也说明了利用中性蛋白酶酶解米渣制备蛋白发泡粉的可行性。同时中性蛋白酶作用条件温和，价格低，安全性高。

在以上研究的基础上，本试验以淀粉糖生产的副产品米渣为原料，使用中性蛋白酶酶法改性米渣蛋白制备食用发泡粉，采用响应面分析法优化了制备米渣蛋白发泡粉的工艺条件，并通过高效液相凝胶色谱法和扫描电镜手段从分子结构层面上探讨了酶解米渣蛋白质发泡性能增加的机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试验材料

米渣:合肥锦泰糖业有限公司;中性蛋白酶(酶活270 000 U/g):苏州维邦生物科技有限公司;糖化酶(酶活15 000 U/g):苏州维邦生物科技有限公司;糖用活性炭:江苏竹溪活性炭有限公司;细胞色素C(Mr12 500)、杆菌酶(Mr1 450)、乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸(Mr451)、乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸(Mr189)(分子质量校正曲线所用标准品):上海恒远生物科技有限公司。

1.1.2 试验仪器与设备

DF－101T型集热式恒温磁力搅拌器:巩义市予华仪器有限责任公司;TD5A－WS台式低速离心机:湘仪离心机仪器有限公司;SKD－200凯氏定氮仪:上海沛欧分析仪器有限公司;JJ－2B型组织捣碎机:金坛市国旺实验仪器厂;DZF－6050型真空干燥箱:上海三发科学仪器有限公司;OPD－8喷雾干燥机:上海大川原乾燥设备有限公司;LFT－3型精密过滤机:特威药化设备有限公司;Waters600高效液相色谱仪(配2487紫外检测器和含有GPC数据处理软件的色谱工作站):美国沃特斯仪器公司;Sirion 200场发射扫描电子显微镜:美国FEI公司。

1.2 试验方法

1.2.1 米渣蛋白发泡粉的制备工艺流程

米渣经脱糖，中性蛋白酶酶解，脱色，喷雾干燥等主要步骤制得蛋白发泡粉，工艺流程如图1。

图1 蛋白发泡粉的制备工艺流程

1.2.2 米渣脱糖方法

取米渣20 g，按30 U/g加入糖化酶，反应温度50 ℃，pH 4.6，时间 3 h，固液比 1∶5。反应结束后抽滤，再将抽滤后的米渣用90℃热水水洗30 min，再抽滤。热水洗3次。将抽滤后的米渣于50℃真空干燥箱中干燥，备用。

1.2.3 中性蛋白酶酶解米渣方法

取米渣20 g于烧杯中，按照试验设计的料液比加入定量的蒸馏水，保鲜膜封口，置于恒温水浴锅中保温至设定的温度。用0.5 mol/L的NaOH调pH至设定值。再加入一定量的中性蛋白酶，反应过程中持续搅拌，并维持恒定的pH。反应结束后，沸水浴10 min，灭酶。冷却后离心15 min，弃去残渣，得酶解液。

1.2.4 活性炭脱色方法

取1.2.3中所得酶解液100 mL于烧杯中，置于恒温水浴锅中保温至50℃，并调节至pH 6.5，保鲜膜封口。加入4%的活性炭，脱色30 min。用硅藻土做助滤层，抽滤除去活性炭，得脱色后的酶解液。中试时用精密过滤机除去活性炭。

1.2.5 喷雾干燥方法

将1.2.4制得的脱色后的酶解液进行喷雾干燥。进口温度220℃，出口温度90℃。

1.2.6 总氮含量的测定

按照GB/T 5009.5规定的方法测定。

1.2.7 发泡性测定方法［13］

量取1.2.3中所得酶解液100 mL于组织搅拌机中，以10 000 r/min的速度搅打2 min，搅打结束后，将其转移至500 mL的量筒中，读出泡沫的高度，此体积即为发泡力(单位是mL)。

1.2.8 发泡粉相对分子质量分布的测定

凝胶色谱法:色谱条件:色谱柱 TSKgel2000 SWXL300 mm ×7.8 mm;流动相:乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1(体积比);检测波长:UV220 nm;流速:0.5 mL/min;柱温:30 ℃;进样体积:10 μL。

样品制备:称取发泡粉20.0 mg于10 mL容量瓶中用流动相定容至刻度，超声震荡10 min，用微孔滤膜过滤后进样。

1.2.9 发泡粉微观形态观察

采用场发射扫描电子显微镜观察发泡粉的微观形态。

剪取静电双面胶带置于扫描电镜载物台上，然后挑取少量发泡粉洒在双面胶带上，并轻轻晃动使其分布均匀，再用吸耳球吹去多余的发泡粉，使发泡粉尽量不堆积在一起，放入镀金器中进行喷碳镀金。电子枪加速为20 kV，且在不同的放大倍数下扫描和拍照。

1.3 试验设计

1.3.1 中性蛋白酶酶解液发泡力的单因素试验

选取加酶量即酶与底物比(E∶S)、酶解时间、料液比、pH、温度5个因素，考察酶解液发泡力的变化趋势。

1.3.2 中性蛋白酶酶解液发泡力的响应面试验

在单因素的基础上，选择加酶量、酶解时间、料液比3个因素进行响应面试验。选取的因素与水平见表1。

表1 二次正交中心组合设计因素水平编码表

1.4 数据处理

试验数据采用SAS分析软件处理。

2 结果与分析

2.1 发泡力单因素试验

2.1.1 加酶量对发泡力的影响

固定酶解条件:酶解时间3 h，温度40℃，料液比 1∶10，pH 7.0 。分别选择加酶量 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%6 个水平进行试验，考察加酶量对发泡力的影响，结果如图2。

图2 加酶量对发泡力的影响

由图2可以看出，加酶量对发泡力的影响较大，整体趋势是随着加酶量的增加，发泡力先增大后减小。加酶量过少(0.5%)和过多(3.0%)，酶解液的发泡力都很低，当加酶量在1.0%～2.5%时，发泡力比较高，1.0%时发泡力最高，所以后续的单因素试验都选择1.0%的加酶量。

2.1.2 酶解时间对发泡力的影响

固定酶解条件:加酶量1.0%，料液比1∶10，温度40 ℃，pH 7.0。分别选择酶解时间 0.5，1，2，3，4，5 h 6个水平进行试验，考察酶解时间对发泡力的影响，结果如图3。

由图3可知，酶解时间对发泡力的影响也较显著。前3个小时发泡力随着时间的增加逐渐升高，当时间到达3 h时，发泡力达到最大，之后，再随着时间的增加，发泡力开始逐渐下降。可见3 h时，在固定条件下，发泡力达到最佳水平。所以后续试验选择酶解时间为3 h。

图3 酶解时间对发泡力的影响

2.1.3 料液比对发泡力的影响

固定酶解条件:加酶量1.0%，酶解时间3 h，温度 40 ℃，pH 7.0。分别选择料液比 1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，1∶10，1∶11，1∶12 共 7 个水平进行试验，考察料液比对发泡力的影响，结果如图4。

图4 料液比对发泡力的影响

由图4可以看出，料液比对发泡力也有较大影响。发泡力随料液比的变化趋势是先升高后降低。当料液比为1∶10时，发泡力最高。所以选择1∶10为最佳料液比。

2.1.4 pH 对发泡力的影响

固定酶解条件:加酶量1.0%，酶解时间3 h，料液比1∶10，温度40℃。由于所用中性蛋白酶的最适pH 为6.5～7.5，所以分别选择 pH 6.50，6.75，7.00，7.25，7.50共5个水平进行试验，考察pH对发泡力的影响，结果如图5。

图5 pH对发泡力的影响

由图5可以看出，在酶的最适pH范围内，发泡力随pH增大而升高，但其变化幅度不大。说明在pH 6.5～7.5范围内，pH对发泡力的影响不大。当pH 7.5时，发泡力最大，所以选择pH 7.5作为酶解的最佳pH水平。

2.1.5 温度对发泡力的影响

固定酶解条件:加酶量1.0%，酶解时间3 h，料液比1∶10，pH 7.5。由于所用中性蛋白酶的最适温度范围为40～60℃，所以分别选择随温度为40，45，50，55，60℃ 5个水平进行试验，考察温度对发泡力的影响，结果如图6。

图6 温度对发泡力的影响

由图6可知，在酶的最适温度范围内，随着温度的升高，发泡力在265～272 mL范围内变化，可见，在40～60℃范围内，发泡力受温度的影响不大。选择单因素的最佳值45℃作为酶解的最优温度条件。

2.2 响应面试验

2.2.1 回归方程的建立与显著性分析

在单因素试验的基础上，选定酶解pH 7.5，酶解温度45℃，并以发泡力作为指标，选择加酶量、酶解时间、料液比这3个对发泡力影响较大的因素进行响应面试验。根据二次正交中心组合试验设计，选择23个处理组，试验结果见表2。

运用SAS数据统计分析软件对试验数据进行多元回归拟合，得到回归方程，以及回归方程方差分析表。Y= －596.35+136.25X1+73.91X2+143.16X3－32.36X12－17.50X1X2－X1X3－9.86X22－0.50X2X3－7.21X32

由表3 可知，失拟项 F1=0.29 ＜ F0.05(5，13)=3.03，P=0.91 ＞0.05，即失拟是不显著的，说明不存在影响试验的其他不可忽略的因素;回归项F2=11.64 ＞ F0.01(9，13)=4.19，P=0.0001 ＜ 0.01，即响应面回归模型极显著，说明该模型拟合度较好，试验误差小。其中一次项，二次项都达到了极显著水平，交互作用也达到了显著水平。模型的相关系数R2为88.96%，表示约89%的发泡性变化可以用此模型来解释，所以可以用此模型对发泡力进行分析和预测。

表2 二次正交中心组合设计及结果

表3 二次回归模型方差分析

从回归系数的T检验结果(表4)可以看出，单因素中，加酶量(X1)对发泡力有显著性影响(P＜0.05);时间(X2)对发泡力影响极显著(P ＜0.01);料液比(X3)在α=0.1水平上对发泡力影响显著(P ＜0.1)。双因子中，、X1X2对发泡力影响极显著(P ＜0.01)。

表4 二次正交中心组合设计回归分析结果

2.2.2 显著性交互作用对发泡力的影响

由表4分析中可知，交互作用中X1X2对发泡力影响极显著，为了进一步考察X1X2之间的交互作用对发泡力的影响，作响应面图及等高线图如图7。

图7 Y=f(X1，X2)的响应曲面图及其等高线图

由图7，等高线呈椭圆形，说明加酶量与时间的交互作用对响应值发泡力的影响较大。

固定料液比为1∶10时加酶量与时间的响应曲面图如图7。由响应曲面可以看出，固定时间为某一值时，随着加酶量的增加，发泡力先增加，后降低。固定加酶量为某一值时，随着时间的增加，发泡力也是先增加后降低。当加酶量在1.16%～1.67%，时间在1.32～3 h时对提高发泡力最为有利。

2.2.3 最佳酶解条件的确定

用SAS软件对试验结果进行分析优化可得最佳酶解条件为加酶量1.33%，酶解时间2.16 h，料液比1∶10，预测最大发泡力为277 mL。按照SAS软件分析所得的最佳条件，进行验证，酶解液发泡力可达275 mL。

2.3 发泡粉蛋白的相对分子质量分布

蛋白质的发泡性与蛋白质分子表面的极性和蛋白质分子的大小密切相关。良好的蛋白质发泡性需要合适的分子大小［14］，而通过控制酶解条件如加酶量或酶解时间就可能获得相对分子质量分布不同的酶解物组分［15］，因此可以将酶解物的相对分子质量控制在适宜发泡的范围内。为了了解上述试验中用中性蛋白酶制备的蛋白发泡粉的相对分子质量分布状况，采用高效液相凝胶色谱法对其的相对分子质量分布状况进行分析，分析色谱图如图8。

图8 发泡粉蛋白的相对分子质量分布

由图8可知，发泡粉蛋白的相对分子质量的峰集中出现在18～27 min，其中相对分子质量在189～500之间的占62.24%，相对分子质量在500～1 000之间的占26.33%，说明水解出来的主要是寡肽，总共占88.57%。寡肽具有良好的溶解性，而良好的溶解性是表现蛋白质功能性(发泡性)的基础［16］。且本研究选择中性蛋白酶酶解米渣，其仅水解羧基端是Tyr、Trp、Phe等芳香族疏水性氨基酸残基的肽键，从而保证了水解蛋白的一定的疏水性。综上，发泡粉在溶解性(亲水性)和疏水性之间达到了一定的平衡，从而具有良好的发泡性。

2.4 发泡粉的微观形态

通过电子扫描显微镜(SEM)观察了发泡粉的微观形态，并与原料米渣进行比较，如图9。

由图9可以看出，原料米渣蛋白质由于经过高温变性，形成了高分子聚集体，形状不规则，表面凹凸不平并堆积在一起，而经过酶解改性的发泡粉则呈大小不一的球状结构。由此可知，原料米渣的块状结构难以与水分子充分接触，溶解性差，而经过喷雾干燥工艺的发泡粉的球状结构，使得水分子可以容易地进入其中，大大增加了水解蛋白的比表面积，溶解性也大大增加。同时酶解使蛋白质分子发生了结构重排，因此原来包埋于蛋白质分子内部的疏水性基团暴露到水相中［17］。所以，经过中性蛋白酶的酶解，米渣蛋白质由大分子变成了小分子，蛋白质结构也发生了变化，比表面积增加，溶解性增加，从而蛋白质的功能性(发泡性)与原料蛋白质有很大差别，发泡性也就得到了改善。

图9 米渣和蛋白发泡粉扫描电镜图(×5 000)

2.5 发泡粉的主要质量指标

经1.2.1的工艺步骤制得的蛋白发泡粉的主要质量指标如表5。

表5 发泡粉的主要质量指标

3 结论

3.1 在单因素试验的基础上，选定酶解pH 7.5，酶解温度45℃，并选择对发泡力影响较大的3个因素加酶量、酶解时间、料液比进行响应面试验。以发泡力为指标，经SAS软件分析得到中性蛋白酶酶解的最佳工艺条件为:加酶量1.33%，酶解时间2.16 h，料液比1∶10;理论预测最大发泡力为277 mL，经验证，酶解液的发泡力为275 mL，验证结果与预测结果差别不大，说明已建立的数学模型可用于发泡力的工艺条件优化。

3.2 通过高效液相凝胶色谱测定发泡粉蛋白的相

对分子质量分布状况可知，发泡粉的相对分子质量在189～500之间的占62.24%，相对分子质量在500～1 000之间的占 26.33%，因此寡肽总共占88.57%，具有良好的溶解性;而中性蛋白酶酶解改性又保证了酶解物的一定的疏水性，所得发泡粉在溶解性和疏水性之间取得了一定的平衡，从而发泡性得到提高。

3.3 通过扫描电镜图可以看出经过中性蛋白酶的酶解，米渣蛋白的结构发生了变化，比表面积大大增加，溶解性增加，功能性也随之改变，从而发泡性也就得到改善。

3.4 经脱糖，酶解，脱色，喷雾干燥工艺制备的大米蛋白发泡粉呈乳黄色，无异味，发泡性能良好(3%的发泡粉溶解搅打后可获得泡沫高度为7 cm)，蛋白质含量高。

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Research on RSM Optimization of Preparation of Rice Dregs Foaming Protein

Wu Yujing Du Xianfeng
(College of Tea and Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036)

The foam powder with high protein content is obtained from rice dregs after removal of sugar，enzymatic hydrolysis，decoloration and spray dying.It is milky and odorless.It also has excellent foaming properties.In the single factor test，enzyme dosage，enzymatic time，and the ratio of stuff to liquid have lager impact on foaming ability.Then the response surface methodology(RSM)is used to optimize the conditions of enzymatic hydrolysis of neutral protease.The mechanism of the increase of foaming ability is also explained by high performance liquid chromatography(HPLC)and scanning electron microscopy(SEM).The result shows that the optimum conditions are as follows:enzyme dosage/substrate(E∶S)is 1.33%;enzymatic time is 2.16 h;and the ratio of stuff to liquid is 1∶10.The highest foaming ability in theory is 277 mL and the actual value is 275 mL.

rice dregs，enzymolysis，neutral protease，foam powder

TS209

A

1003－0174(2012)09－0096－07

安徽省战略性新兴产业科技计划(11010302147)

2011－12－20

吴雨静，女，1986年出生，硕士，食品科学

杜先锋，男，1964年出生，教授，博士生导师，食品生物技术及农副产品深加工技术