央芪汤流浸膏敷贴制剂对胃癌动物模型的干预作用研究*

唐万和 孙易娜 赵雷 唐思思 王国金 王红荣 王熙 余智勇 蔡昂

央芪汤流浸膏敷贴制剂对胃癌动物模型的干预作用研究*

唐万和①孙易娜①赵雷②唐思思③王国金①王红荣①王熙①余智勇①蔡昂①

目的：通过将央芪汤制作成流浸膏制剂，检测央芪汤流浸膏制剂对胃癌动物模型中瘤体的抑制作用。方法：将人胃癌SGC-7901细胞悬液皮下接种于裸鼠背部皮下，当接种部位肿瘤长至最大径4~5 mm时，将裸鼠随机分为四组(10只/组)：A组(央芪汤敷贴剂)；B 组(氟尿嘧啶注射液)；C组(央芪汤敷贴剂+氟尿嘧啶注射液)；D组(生理盐水对照组)。给药期间观察裸鼠的一般情况及移植瘤的生长状况，连续用药24 d，并继续观察4 d后，颈椎脱位处死裸鼠，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法检测bcl-2及caspase-3蛋白。结果：央芪汤流浸膏可明显提高胃癌细胞株SGC-7901在裸鼠皮下移植瘤的caspase-3蛋白表达，显著抑制SGC-7901在裸鼠皮下移植瘤抗凋亡蛋白bcl-2的表达。结论：央芪汤流浸膏可以明显增加荷瘤裸鼠肿瘤细胞凋亡，有明显差异，表明央芪汤流浸膏可以通过促进胃癌细胞的凋亡达到抗肿瘤的目的。

央芪汤流浸膏； 胃癌； bcl-2； caspase-3； 中医药

央芪汤是武汉市中医医院肿瘤科唐万和主任在治疗胃癌的临床实践中总结出来的经验方。临床研究表明，该方可以稳定瘤体，延长消化道肿瘤患者的生存时间，提高患者的生存质量。前期研究提示其可促进肿瘤细胞凋亡。本研究通过将央芪汤制作成流浸膏敷贴制剂，改善药物透过角质层的穿透性，提高药物渗透量，增强治疗效果。在此基础上，综合应用现代免疫学、分子生物学等研究方法，进一步揭示央芪汤治疗肿瘤的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 BALB/c(nu /nu)裸小鼠，由北京联合利华公司提供。4~6周龄；体重：16~20 g；雌性；饲养于无特定病原体(SPF)条件下。动物饲料由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

1.1.2 细胞株 人胃低分化腺癌细胞株SGC-7901，来自华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室。

1.1.3 药物 央芪汤流浸膏，由猪央央、生黄芪、败酱草、白英、白及、党参、蒲公英、白花蛇舌草、半枝莲、猴头菇等药物组成，中药由武汉市中医医院药学基地提供。

1.1.4 主要试剂 抗人caspase-3 IgG，抗人Bcl-2 IgG，Annexin V -FITC /P I双染试剂盒，免疫组化S-P试剂盒，RPMI1640培养基，胰蛋白酶，10%胎牛血清。

1.1.5 主要仪器设备 IMT-2型倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)，SW-CJ-2FD型医用超净工作台(苏州净化集团公司)，水浴箱XMT-DA数显调节仪(北京光明仪器厂)，NAPC02-5420-1型CO2细胞培养箱(美国精密科学公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 央芪汤流浸膏制备 将由猪央央、生黄芪、败酱草、白及、蒲公英、党参、白花蛇舌草、白英、半枝莲、猴头菇等药物组成的央芪汤制成流浸膏。

1.2.2 人胃癌SGC-7901 细胞株的培养及传代 将SGC-7901细胞吸尽上清液，PBS 液洗涤2次，加入0.25%胰蛋白酶溶液0.5 ml，放置37 ℃恒温水浴箱中5 min，振荡后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，摇匀后分瓶，放入5%CO2细胞培养箱中孵育。倒置显微镜下观察细胞贴壁生长情况，长满瓶底后如上法分瓶孵育，直至所需的细胞数。

1.2.3 细胞计数与存活测试 取清洁血球计数板、盖玻片，用0.4%台盼蓝染液与细胞悬液混匀，从盖玻片一侧计数板凹槽加入，于低倍倒置显微镜下观察计数四角大分格中的细胞数。

1.2.4 皮下移植瘤模型的建立 将人胃癌SGC-7901细胞用0.2%胰酶消化成细胞悬液，无血清RPMI-1640培养基调整细胞浓度至1.0×106个/ml，台盼蓝染色记数活细胞>95%。用1.0 ml 微量注射器将0.2 ml细胞悬液皮下接种于裸鼠右侧背部皮下，每只接种0.2 ml。

1.2.5 实验分组 当接种部位肿瘤长至最大径4~5 mm时，将裸鼠随机分为四组(10只/组)：A 组(央芪汤敷贴剂)：央芪汤敷贴剂外敷荷瘤裸鼠背部皮肤；B 组(氟尿嘧啶注射液)：荷瘤裸鼠腹腔注射氟尿嘧啶注射液；C 组(联合组)：荷瘤裸鼠腹腔注射氟尿嘧啶注射液，央芪汤敷贴剂外敷荷瘤裸鼠背部皮肤，1次/d；D 组(空白组)：腹腔注射生理盐水。

1.2.6 药物治疗 A 组：在裸鼠体表肿瘤部位敷贴央芪汤流浸膏，1次/d。B组：腹腔注射氟尿嘧啶注射液，给药剂量1 mg/kg，1次/d。 C组：外敷央芪汤流浸膏同时予以腹腔氟尿嘧啶注射，1 mg/kg，1次/d。D组：裸鼠腹腔注射生理盐水1 mg/kg，1次/d。

1.2.7 免疫组织化学法染色实验 采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法检测bcl-2及caspase-3蛋白。肿瘤组织于10%中性缓冲甲醛中固定24 h，石蜡包埋，连续切片。贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片，60 ℃烤片2 h。组织切片脱蜡，梯度乙醇水化，细胞固定。放进3% H2O2-甲醇液， 室温下20 min。1% Triton X-100 37 ℃ 5 min，水洗，PBS洗。正常山羊血清室温20 min。滴加兔抗P65 IgG，4 ℃过夜。PBS洗，滴加Biotin-羊抗兔IgG，37 ℃，30 min。PBS洗，滴加HRP标记链霉亲和素，37 ℃，30 min。PBS洗3×5 min 后，DAB 显色；常规脱水、透明、封片。结果判定: 阳性物质呈棕黄色。每张免疫细胞化学片在20×10的倍数下随机选取5个视野，计算总细胞数和阳性细胞数及阳性率。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件包进行统计分析，实验数据用(±s)表示，多组均数间的比较采用F 检验，多重比较采用q检验。

2 结果

药物干预24 d后，央芪汤流浸膏可以提高胃癌细胞株SGC-7901在裸鼠皮下移植瘤的caspase-3蛋白表达，央芪汤流浸膏组和联合组与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。央芪汤流浸膏组与联合组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图1。

表1 央芪膏、氟尿嘧啶对SGC-7901裸鼠皮下移植瘤caspase-3的影响(±s)

表1 央芪膏、氟尿嘧啶对SGC-7901裸鼠皮下移植瘤caspase-3的影响(±s)

组别 caspase3 A组(n=10) 384245.33±17708.68 B组(n=10) 170955.93±12090.22 C组(n=10) 222563.57±16886.38 D组(n=10) 107102.38±14598.87

图1 各组caspase3免疫组化图片

央芪汤流浸膏可以显著抑制SGC-7901在裸鼠皮下移植瘤抗凋亡蛋白bcl-2的表达，与对照组相比，抑制率明显提高(P<0.05)。与5-FU组相比，抑制率亦提高(P<0.05)。见表2、图2。

表2 央芪膏、氟尿嘧啶对SGC-7901裸鼠皮下移植瘤bcl-2的影响(±s)

表2 央芪膏、氟尿嘧啶对SGC-7901裸鼠皮下移植瘤bcl-2的影响(±s)

组别 Bcl-2 A组(n=10) 149071.26±24145.68 B组(n=10) 548097.68±30145.27 C组(n=10) 474247.66±28822.81 D组(n=10) 684670.14±33694.61

图2 各组bcl-2免疫组化图片

3 讨论

3.1 胃癌与caspase3、Bcl-2的生物学特性关系 近年来，中医药在肿瘤的防治中发挥着重要的作用，尤其是中西医结合治疗恶性肿瘤能明显提高肿瘤治疗的疗效，延长患者的生存时间。随着高科技实验方法的渗透，中医药防治肿瘤的作用机制正逐渐被现代医学研究所揭示。

研究发现，细胞凋亡在胃上皮细胞转化、溃疡以及肿瘤形成、进展、转归中起着非常重要的作用。凋亡率可作为胃癌患者预后评估的一个重要指标。目前普遍认为，诱导凋亡是成功治疗肿瘤的关键。Caspase是一组半胱天冬蛋白酶家族，其在细胞凋亡过程中起着重要作用。Caspase3是已知该家族成员中执行细胞凋亡的关键酶之一，被细胞外各种凋亡信号激活后，使胞质、胞核及细胞骨架的重要蛋白酶失活，从而引发细胞凋亡。Caspase3是细胞凋亡途径末端底物酶解的关键效应蛋白酶[2]，其表达意味着细胞死亡。探讨Caspase3蛋白在胃癌发生过程中的作用有助于胃癌的防治。

Bcl-2蛋白家族是重要的细胞凋亡调节因子，其主要功能是作为一个信号锚定序列，负责定位和插入到线粒体外膜，抑制细胞凋亡，是迄今研究最深入、最广泛的凋亡调控基因之一。在前列腺癌、膀胱癌等中都有Bcl-2表达增强[3]。Bcl-2对细胞凋亡的负性调节作用表现在对细胞凋亡的抑制上，这种结果将允许分裂细胞的累积和阻止带有恶性潜能基因的改变，促进癌变的发生[4-5]。

本实验中采用动物皮下移植瘤模型，研究央芪汤流浸膏对胃癌组织凋亡的影响。通过检测Bcl-2和Caspase3的表达，发现央芪汤流浸膏药物组Caspase3增高，Bcl-2降低，结论符合凋亡检测结果。央芪汤流浸膏可以提高胃癌细胞株SGC-7901在裸鼠皮下移植瘤的caspase-3蛋白表达，央芪汤流浸膏组和联合组与对照组相比差异有统计学意义。央芪汤流浸膏组与联合组相比，差异无统计学意义。央芪汤流浸膏可以显著抑制SGC-7901在裸鼠皮下移植瘤抗凋亡蛋白bcl-2的表达，与对照组及 5-FU组相比，抑制率明显提高。

3.2 央芪汤流浸膏治疗胃癌的探讨 中医对胃癌的治疗有着非常丰富的经验，胃癌属于祖国医学“胃脘痛” “痞满”“ 反胃”“呃逆”等范畴。胃为水谷之海，百物聚集之所，多气多血之脏，饮食药物，先伤于胃，物聚类杂，最易壅塞。故本病多系饮食不节，忧思过度而损伤脾胃；或外邪内阻，致使清气不升，浊气不降，营气不从，逆于肉里，日久腐蚀胃腑致胃失和降，脾胃升降功能失常，痰凝气滞，交阻于胃，积聚成块是胃癌的主要病因，正气亏虚、脏腑功能失调是发病的内在因素。祖国医学认为，肿瘤是由于正气亏虚、气滞血瘀、邪毒积聚而成。“正虚积自成”、“ 邪之所凑，其气必虚”。中晚期胃癌患者大多正气虚弱，免疫功能低下。在中晚期胃癌的治疗中，化疗在取得一定疗效的同时，也对正常组织细胞产生破坏作用，抑制机体的免疫功能和骨髓造血功能，此即所谓祛邪亦伤正，致使患者生活质量低下，生存时间缩短。央芪汤由猪央央、黄芪、败酱草、白及、白英、蒲公英等药物组成。方中黄芪为补中益气要药，与党参等补气健脾药物配伍，对脾气虚弱、倦怠乏力者疗效明显。多项研究表明，黄芪对胃癌、结肠癌、肝癌、肺癌等肿瘤均有明显的抗癌作用，也可增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性[6]。党参补气之力较为平和，专注于补益脾肺之气，且能补血，对胃癌患者常见的贫血能起到较好的治疗作用。白花蛇舌草为苦寒之品，有较强的清热解毒功效，用于治疗热毒所致的诸证，近年来常与猪央央、白英等清热解毒之品广泛用于各种癌症的治疗。

央芪汤作为传统中药，煎煮过程较为繁琐，消化道肿瘤患者普遍存在的恶心呕吐等症也给口服用药带来了一定的麻烦。另外，中药的口服给药或注射给药在时间-血药浓度曲线上常出现“峰谷”现象。当血药浓度处于谷底时，难以充分发挥药效，处于峰顶时，又会产生毒性。因此，探寻新的给药方式显得尤为重要。中药敷贴疗法是祖国医学外治法中的瑰宝，以其安全、方便、减少给药次数等而为患者所接受。在临床各科中，其以较好的临床疗效受到了患者和医家的喜爱。它不经过肝脏的“首过效应”，维持稳定、持久的血药浓度，降低了药物的毒副作用。中药敷贴疗法属于现代透皮给药系统，是继口服液、注射液之后制剂研究的新热点，透皮贴剂已经在多种药物中成功开发。本项目研究通过将央芪汤制作成流浸膏敷贴制剂，改善药物透过角质层的穿透性，增强了疗效。而且，从实验过程中可见，央芪汤流浸膏敷贴制剂对裸鼠的皮肤未造成损害，是一种安全、有效的治疗方法。

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10.3969/j.issn.1674-4985.2012.24.009

2010武汉市卫生局临床医学科研项目(编号：WZ10E03)

①武汉市中医医院 湖北 武汉 430014

②华中科技大学同济医学院附属协和医院

③华中科技大学同济医学院附属同济医院

孙易娜

2012-04-06) (本文编辑：陈丹云)