PCR-荧光探针法检测临床痰标本结核分枝杆菌的可靠性研究

梁建琴 高华方 李洪敏 赵智贤 张广宇 王金河 王甦民 刘佳文

目前传统的Mtb菌种鉴定和检测方法如萋-尼染色、罗氏培养方法等，或灵敏度不高，易污染；或耗时长，易延误诊断治疗；或仪器设备昂贵，难于普遍开展。开发灵敏度高，耗时短，成本低廉易普及的检测方法成为大势所趋。而新近引入的PCR-荧光探针杂交技术灵敏度高、特异度高，成为研究的热点。PCR-荧光探针杂交技术检测临床痰标本，有研究报道其特异度和灵敏度均达到理想的水平，且检测快捷方便。本研究通过PCR-荧光探针法（博奥生物有限公司，分枝杆菌核酸检测试剂）快速检测和鉴别Mtb和非结核分枝杆菌（NT M），评价其在检测临床标本中Mt b的应用价值，有利于指导临床开展早期有效的化疗。

材料和方法

一、材料和试剂

1．患者情况：2009年1月至2010年12月解放军第三〇九医院、北京市老年病医院和北京结核病控制研究所门诊或住院诊断明确的患者1015例，其中，男性763例，女性252例，年龄19～86岁，平均年龄（46．8±12．3）岁，住院患者收集晨痰，门诊患者收集即时痰液，所有患者均做过痰涂片或培养，结果见表1。其中非肺结核病患者痰标本274例，包括肺癌患者92例、支气管哮喘患者59例、慢性支气管炎患者102例，支气管扩张患者21例，来源于解放军第三〇九医院165例和北京市老年病医院109例；肺结核患者痰标本741例，其中解放军第三〇九医院158例、北京市老年病医院279例和北京结核病控制研究所304例。肺结核的诊断标准符合参考文献［1］，其中菌阳（痰涂片或痰培养阳性）肺结核265例，菌阴肺结核476例。凡是该阶段参与该研究的检验人员收集的痰标本均为纳入对象，进行痰涂片和痰培养；另有1名参与该研究的技师对收集的痰标本行PCR-荧光探针法检测，并对对应患者的诊断进行追踪，统计结果进行分组。

2．菌株材料：分枝杆菌临床分离株56株，其中解放军第三〇九医院29株；北京市老年病医院14株；北京结核病控制研究所13株。其中1株为Mtb，55株为NT M。分枝杆菌标准菌株（ATCC 27294）由中国药品生物制品检定所提供。

3．试剂：分枝杆菌核酸检测试剂，博奥生物有限公司生产；实时荧光定量PCR仪，型号ABI7700，由博奥生物有限公司提供。Mt b核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒（目前临床上认可惟一同类产品）由中山大学达安基因股份有限公司提供。

二、方法

PCR具体操作步骤按照说明书进行。PCR结束后，根据样品所在反应管内荧光信号到达设定域值时所经历的循环数（Ct值）判断是否存在Mt b或NT M，Ct值＜40，为阳性。FA M（绿色）通道阳性，VIC（黄色）通道阴性，为 Mt b；FA M通道阳性，VIC通道阳性，为Mtb；FA M通道阴性，VIC通道阳性，为NT M；FA M通道阴性，VIC通道阴性，无分枝杆菌。试验在解放军第三〇九医院、北京市老年病医院和北京结核病控制研究所三家单位分别进行。操作者均是经过博奥生物有限公司统一培训的技术人员，结果由解放军第三〇九医院结核病研究所汇总形成研究总结报告。

对临床医生需要检测报告的226份标本进行了达安公司试剂盒检测。

对检测结果与诊断不相符者、两个试剂盒检测结果不一致者、检测结果为NT M者，扩增标本送检50～100μl到上海生物工程有限公司进行16Sr DNA测序确认。

三、评价项目

统计灵敏度（包括菌阳灵敏度和菌阴灵敏度）、特异度、阳性预测值、阴性预测值等。并对该研究检测结果和达安试剂盒（已经上市）检测结果进行χ2检验分析，判断差异是否有统计学意义。

四、评价方法

为便于分析统计，按照临床诊断、培养或涂片结果和PCR-荧光探针法结果分为6组（表1）。菌阳肺结核荧光探针法阳性组（A组），菌阳肺结核荧光探针法阴性组（D组），菌阴肺结核荧光探针法阳性组（B组），菌阴肺结核荧光探针法阴性组（C组），非肺结核荧光探针法阳性组（E组），非肺结核荧光探针法阴性组（F组）。三家医院分别对各自医院的标本同时进行达安试剂盒检测，每个试验都是一次性的结果。计算PCR-荧光探针法试剂盒灵敏度（包括菌阳灵敏度和菌阴灵敏度）、特异度、阳性预测值及阴性预测值。阳性预测值（%）＝（真阳性例数／荧光探针法检测阳性例数）×100%，阴性预测值（%）＝（真阴性例数／荧光探针法检测阴性例数）×100%。

与达安公司试剂盒检测结果进行阳性符合率、阴性符合率、总符合率的比较，采用SPSS 11．5统计软件进行数据统计处理，率的比较采用χ2检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

一、PCR-荧光探针法直接检测痰标本结果

265例菌阳肺结核的痰标本，应用PCR-荧光探针法检测出Mt b核酸阳性标本252例，检测阳性率为95．1%（252／265），检测出 NT M 核酸阳性标本5例，检测阳性率1．9%（5／265），8例标本检测为阴性，菌阳检测灵敏度为97．0%（257／265）；476 例菌阴肺结核的痰标本中，应用PCR-荧光探针法Mt b核酸阳性 110 例，检出率为 23．1% （110／476），NT M 核酸阳性6例，检出率为1．3%（6／476），菌阴肺结核标本检测灵敏度为24．4%（116／476）；274例非肺结核患者的痰标本中Mtb阳性标本3例，假阳性率为1．1%（3／274），3例痰标本经16S r DNA 测序确认为结核分枝杆菌复合群。PCR-荧光探针法检测痰标本分枝杆菌灵敏度为50．3%（373／741），特异度为98．9%（271／274），阳性预测值 99．2%（373／376），阴性预测值42．4%（271／639）。1015份临床痰标本中共检测出11份NT M核酸阳性标本（占1．1%），经 16S r DNA 测序确认，准确率为100．0%。1015份痰标本统一编号，随机数字量表法选取138份重复进行PCR荧光探针法检测，结果一致率100．0%（表1）。

二、PCR-荧光探针法检测临床分离株结果

对56份临床分离株进行检测，1例Mt b核酸阳性，55例NT M核酸阳性，准确率100．0%。

三、与达安公司试剂盒检测比较结果

与达安公司试剂盒比较，该研究检测结果的阳性符 合 率 为 92．4% （122／132），阴 性 符 合 率 为98．9%（93／94），总体符合率为95．1%［（93＋122）／226］，经卡方分析，χ2＝2．98，P＝0．226，两种检测方法之间差异无统计学意义（表2）。

与达安公司试剂盒比较，共有11例不符合标本，其中10例为临床诊断肺结核患者标本。3例达安公司试剂盒检测为Mt b阳性，博奥试剂盒检测结果为NT M，16Sr DNA测序证实为NT M；1例为脓肿分枝杆菌，1例为戈登分枝杆菌，1例为偶发分枝杆菌。6例达安公司试剂盒检测为Mtb，博奥检测结果为分枝杆菌核酸阴性。1例博奥试剂盒检测结果为Mt b核酸阳性，测序证实为Mt b，达安公司试剂盒检测为阴性。另1例临床诊断肺癌的标本，达安公司试剂盒检测为Mt b核酸阳性，博奥试剂盒检测结果为阴性。

讨 论

目前由于荧光定量PCR技术同时具有特异性强、灵敏度高、定量准确、简单易行等优点，已经被广泛应用于 Mt b的检测［2-3］。本研究采用PCR-荧光探针法（博奥生物有限公司分枝杆菌核酸检测试剂盒）对1015例痰标本和56株临床分离株进行检测，检测灵敏度为50．3%，特异度98．9%；并随机抽取138例痰标本进行重复检测，符合率100．0%。随机选取226例标本，其中肺结核标本220例，6例非结核痰标本，与达安公司生产的Mt b检测试剂盒就Mtb检测项进行比较，该研究检测结果的阳性符合率为92．4%，阴性符合率为98．9%，总体符合率为95．1%，经统计分析（P＝0．226），两者之间差异无统计学意义。由于部分患者痰液量较少和经费不足等原因，本研究仅对临床医生需要检测报告的226份标本进行了达安公司试剂盒检测，下一步将开展PCR-荧光探针法检测临床痰标本的大样本、多中心评价，目前两种试剂盒对其余800余份培养分离株的检测正在进行对比分析。

临床工作中，痰菌阴性，经临床综合分析后诊断为肺结核的患者，约占临床肺结核患者的60%～70%［4］。有报道指出痰菌阴性的肺结核患者，如果未经过抗结核治疗，经过1～3年的随访，将有40%～60%的患者发展为菌阳甚至更为典型的肺结核。所以，获得病原学诊断至关重要。本研究利用博奥公司分枝杆菌核酸检测试剂盒对476例临床诊断菌阴肺结核患者的痰标本进行检测，检测出Mt b核酸阳性110例，NT M核酸阳性6例，菌阴肺结核标本检测灵敏度为24．4%（116／476）。目前 PCR-荧光探针法直接用于菌阴肺结核痰标本检测的报道较少，肖海浩等［5］应用抗酸染色涂片、Mt b培养、荧光定量PCR和噬菌体生物扩增4种方法对68例菌阴肺结核患者的支气管灌洗液进行检测，阳性率分别为29．4%、54．4%、33．8%和14．7%，认为灌洗液涂片和荧光定量PCR对菌阴肺结核快速诊断具有重要的临床应用价值。与本研究结果类似，提示PCR-荧光探针法可以作为临床痰涂片和痰培养的补充，为临床诊断和治疗提供帮助。

表1 各组PCR-荧光探针法直接检测痰标本结果

表2 博奥试剂盒与达安公司试剂盒检测Mtb结果的比较（例）

许多分枝杆菌16S r DNA序列是高度保守的，只在某些位置上存在少许核苷酸变化，这些核苷酸变化的位置是分枝杆菌属或种特异的，已经普遍用于分枝杆菌的菌种鉴定工作中［6］。本研究中应用PCR-荧光探针法检测出11例NT M核酸阳性标本（1．1%），经16Sr DNA 测序确认，准确率100．0%；对56株临床分离株（1株Mt b临床分离株，55株NT M临床分离株）检测，检测准确率100．0%。与达安公司试剂盒相比，有11例不符合标本，在10例临床诊断为肺结核患者的标本中，达安公司试剂盒3例检测为Mt b阳性的标本，博奥检测结果为NT M，并经16Sr DNA测序证实为NT M；另外7例中6例达安公司试剂盒检测为Mt b，博奥检测结果为分枝杆菌核酸阴性，1例博奥试剂盒检测结果为Mtb核酸阳性，达安公司试剂盒检测为阴性，可能因为痰液处理过程中核酸丢失出现的假阴性，或是操作过程中污染而呈现假阳性。274例非肺结核患者的痰标本，应用PCR-荧光探针法检测出Mtb核酸阳性标本3例，假阳性率为1．1%（3／274），3例痰标本经16S r DNA测序确认为结核分枝杆菌复合群，其中1例临床诊断为肺癌患者（病理证实为腺癌），用达安试剂盒检测Mtb核酸阳性，判断该患者同时合并Mtb感染；另外2例均为支气管扩张患者，追踪患者病史和肺部CT，考虑2例患者不能排除结核性支气管扩张或者是合并Mtb感染的可能，需进一步追踪明确。

目前，已有大样本结果显示痰液荧光定量PCR检测可获得比涂片镜检明显高的阳性率和略高于培养的阳性率，省时快速，是一种快速、敏感度高、特异度高的 Mtb辅助诊断方法，具有重要的应用价值［7-8］。2010年贺松［9］的 Meta分析认为，从现有的临床证据来看，荧光定量PCR是检测Mtb的有效方法，可推广应用于临床结核病辅助检测。与本研究结果一致。

以上分析表明，PCR-荧光探针法检测Mt b和NT M简便可行，耗时短（仅需1 d时间），检测灵敏度（50．3%）、特异度（98．9%）与抗酸染色（10%、30%）和培养法（30%、40%）相比［10-12］，灵敏度大大提高。本研究发现，博奥生物有限公司分枝杆菌核酸检测试剂与目前常用的达安公司检测试剂盒相比，结果具有一定的可靠性，且同时可检测和鉴别Mtb与NT M，国内外未见类似报道。在临床上可先行PCR-荧光探针法进行初筛，对确定为NT M感染的患者可再进一步行基因芯片杂交分析，可将分枝杆菌鉴定至种，经济实用，缩短了检测时间，对指导临床意义重大。

［1］邹级谦．肺结核诊断标准．结核病健康教育，2008，1：7-9．

［2］Parashar D，Chauhan DS，Shar ma VD，et al．Applications of real-ti me PCR technology to mycobacterial research．Indian J Med Res，2006，124（4）：385-398．

［3］Kraus G，Cleary T，Miller N，et al．Rapid and specific detection of t he Mycobacteriu m t uberculosis co mplex using fluor ogenic pr obes and real-ti me PCR．Mol Cell Pr obes，2001，15（6）：375-383．

［4］王甦民．结核病及其实验技术的现状与展望．中华检验医学杂志，2001，24（2）：71-72．

［5］肖海浩，汤春梅，周强，等．几种支气管冲洗液结核杆菌检测方法对菌阴肺结核的诊断价值．当代医学，2010，16（18）：26-28．

［6］Har msen，D，Rothgänger J，Frosch M，et al．RIDOM：riboso mal differentiation of medical micr o-organis ms database．Nucleic Acids Res，2002，30（1）：416-417．

［7］杨上英．比较分析痰涂片及荧光定量PCR在诊断肺结核中的作用．中外医疗，2011，30（5）：3-4．

［8］唐林国，谭耀驹，何聚莲，等．荧光定量聚合酶链反应技术检测痰结核分枝杆菌DNA及其临床应用研究．医学研究通讯，2005，34（7）：34-36．

［9］贺松．荧光定量PCR检测结核分枝杆菌Meta分析．中国微生态学杂志，2010，22（12）：1129-1132．

［10］邬小薇．3种方法检测结核分枝杆菌的比较．重庆医学，2005，34（10）：1506-1511．

［11］杨松，张耀亭，林素梅．抗酸染色对肺结核的诊断价值．临床肺科杂志，2007，12（4）：328-329．

［12］许蕴怡，罗晓红，易小萍，等．四种结核分枝杆菌检测方法的比较．现代医院，2007，7（10）：61-62．