实时荧光PCR检测儿童肺结核粪便中Mtb-DNA的效果评价

黄慧谦 吴驰 陈建波 杨燕 侯志平 李小勇

2003年WHO估计，每年全球有1～2亿人死于结核病，其中有30万15岁以下儿童死于肺结核。尽管儿童结核病疫情严峻，但长期以来，人们往往对成人结核病给予更多的关注，对于儿童结核病却容易忽视。由于儿童患者痰标本获得困难，阻碍了小儿结核病的诊断。为了获得临床细菌学检查标本往往需要采用侵入性检查方法，如采用纤维支气管镜（简称“纤支镜”）诱导痰或用胃镜吸取胃内容物查找抗酸杆菌，这些方法不仅给患儿带来痛苦，而且也增加了医院感染的风险，并且敏感度不高。

本研究收集临床诊断肺结核的住院儿童的粪便标本，同时采用荧光探针加聚合酶链反应（PCR）相结合的检测方法，初步建立起了应用实时荧光PCR（FQ-PCR）技术快速检测肺结核患儿粪便标本的流程，并对其临床效果进行初步评估。

材料和方法

一、标本来源与分组

实验组：收集本院2010年1月至2011年8月间临床诊断为肺结核并排除肠结核病、年龄小于16岁的住院患儿粪便标本76例作为实验组，实验组中41例患儿可取得痰标本进行培养及抗酸杆菌涂片细菌学检查，进一步分为15例痰菌阳性肺结核患儿、26例痰菌阴性肺结核患儿与35例无痰肺结核患儿3组。住院患者诊断标准符合下列条件之一：痰或纤支镜刷片查抗酸菌涂片阳性；或Mtb培养阳性；或其他治疗无效，影像学检查符合肺结核病诊断［1］。并正规抗结核治疗有效，无肠道结核症状与体征，符合肺结核病演变过程。患儿年龄最小1个月，最大16岁，平均年龄（9．91±5．56）岁。其中男性50例，女性26例，男∶女＝1．92∶1。其中临床诊断为肺结核住院患儿68例，肺结核合并胸膜炎或胸腔积液4例，结核性脑膜炎3例，颈部淋巴结核1例。

对照组：取同时期我院儿科住院的20例其他呼吸系统疾病患儿的粪便标本作为对照组检测FQ-PCR，其中男性12例，女性8例，男女比例为1．5∶1，年龄最小4个月，最大14岁，平均年龄（8．47±4．03）岁，临床诊断上呼吸道感染患儿4例，肺炎6例，疱疹性咽峡炎10例。

二、方法

1．粪便标本预处理：新鲜粪便标本收集在无菌塑料杯中，取回实验室后置入（4℃）冰箱保存，时间不超过48h。取500mg粪便标本加入装有2ml无菌PBS缓冲液（0．05mol／L，pH 7．4）的试管中充分振荡摇匀后，3200×g离心5min，收集上清液，重复上述PBS洗涤离心步骤1次，最终收集上清液1ml置于1．5ml的eppendorf管中。然后上清液16 400×g离心10min，弃上清后，沉淀加入1ml生理盐水中重悬混匀，等分为2份后，16 400×g离心10min，弃上清，保留沉淀，一份标本置于-30℃冰箱中待抽提DNA，另一份标本行涂片检查。所有标本在1h内预处理完毕。

2．试剂盒抽提DNA：粪便标本预处理后采用进口试剂盒（QIAGEN公司QIAamp DNA mini kit）快速提取DNA，痰标本采用中山大学达安基因股份有限公司提供的Mtb核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒提取DNA，具体操作步骤按照说明书进行。

3．FQ-PCR检测 Mtb：Mtb核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供。具体操作步骤按照说明书操作。样本荧光扩增曲线根据说明书进行结果判断分析。

4．Mtb培养和涂片检查：痰Mtb培养参照《结核病细菌学检验规程》［2］，采用法国梅里埃公司BACTEC MGIT 960快速培养系统，阴性标本培养42d，培养阳性标本需涂片检查确认。痰、粪便涂片检查采用金胺O染色，暗视野荧光显微镜下检测，具体操作参照《结核病细菌学检验规程》［2］进行。

三、统计学处理

使用SPSS 11．0统计软件及Excel进行统计分析，两种方法检验结果的比较采用四格表资料分析，计数资料的比较采用卡方检验。检验水准α＝0．05，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

一、粪便标本FQ-PCR检测的敏感度和特异度

实验组76例患儿粪便标本中检出Mtb-DNA阳性18例，敏感度为23．68%；对照组20例其他呼吸系统疾病患儿的粪便标本进行检测，FQ-PCR结果均为阴性，特异度为100．00%。

二、粪便标本FQ-PCR与金胺O染色检测结果的比较

76例患儿粪便标本中，FQ-PCR检测，Mtb阳性18例，阳性率23．68%（18／76）；76例患儿粪便标本同时采用金胺O染色涂片检测，Mtb阳性5例，阳性率仅为6．58%（5／76）。两者均为阳性者5例，两者均为阴性者58例，涂片阴性、FQ-PCR阳性标本13例，涂片阳性而FQ-PCR阴性标本0例（表1）。FQ-PCR检测阳性率明显高于涂片检测，两种方法采用四格表资料的Fisher确切概率法计算（累积概率P＝0．00046，P＜0．05），差异有统计学意义。

表1 两种实验室检测方法对粪便标本检测结果的比较（例）

三、痰细菌学检测阳性、痰细菌学检测阴性与无痰肺结核患儿的粪便标本FQ-PCR结果的比较

41例患儿同时进行了至少1次以上的痰标本的涂片和（或）培养检测（其中痰菌阳性患儿15例、痰菌阴性患儿26例），收集患儿粪便标本进行FQ-PCR检测；另有35例患儿未收集到痰标本，因此只进行了粪便标本的FQ-PCR检测。如表2所示，痰菌阳性肺结核患儿组粪便标本FQ-PCR检测结果阳性10例，阳性率66．67%（10／15）；痰菌阴性肺结核患儿组粪便标本FQ-PCR检测结果阳性1例，阳性率3．85%（1／26）；无痰肺结核患儿组粪便标本PCR检测结果阳性7例，阳性率20．00%（7／35）。两两比较，痰菌阳性患儿与痰菌阴性患儿（χ2＝16．06，P＜0．05）、无痰肺结核患儿 （χ2＝10．19，P＜0．05）FQ-PCR阳性率，差异有统计学意义；痰菌阴性患儿与无痰肺结核患儿FQ-PCR阳性率比较，差异也有统计学意义（χ2＝8．23，P＜0．05）。

表2 痰菌阳性、痰菌阴性肺结核患儿与无痰肺结核患儿粪便FQ-PCR检测结果（例）

四、粪便标本与痰标本FQ-PCR检测结果的比较

41例儿童肺结核患儿同时收集到了粪便和痰标本。取同一患儿的粪便和痰标本进行FQ-PCR检测，其结果如表3所示，粪便标本PCR检测结果阳性11例，阳性率26．83%（11／41）；痰标本 PCR检测结果阳性18例，阳性率43．90%（18／41）；两者均为阳性有11例，两者均为阴性有22例，痰标本阴性、粪便PCR阳性标本1例，痰标本阳性而粪便PCR阴性标本8例。两种方法采用四格表资料χ2检验的校正公式进行比较，差异有统计学意义（χ2＝12．93，P＜0．05）。

表3 同一患者的两种标本FQ-PCR检测结果比较（例）

讨 论

全球结核病疫情发展迅猛，儿童结核病发病率也在增加。长期以来，儿童结核病的诊断与治疗容易被忽视，儿童结核病的误诊率极高。国内有文献统计，超过40%的儿童结核病患者误诊时间大于30d，误诊时间大于90d的患者也不鲜见［3］。儿童结核病诊断较困难最重要的原因之一是，结核病患儿的临床标本留取困难，细菌学检查的方法陈旧且阳性率低。2000年我国痰涂片与培养阳性儿童患者不足6万例，同期据估算全国有活动性肺结核病儿童患者45万例，即大部分结核病患儿为Mtb细菌学检查阴性［4］。

儿童和婴儿无法主动咯出痰标本，本研究实验组76例儿童肺结核患者中，只有41例患儿最终收集到了痰标本进行涂片和（或）培养检测。儿童肺结核患者的痰大部分吞入消化道中，据此，国内外有报道通过插胃管吸取胃液标本查分枝杆菌，诊断的阳性率可达20%～40%［5-6］。虽然抽取儿童胃液进行细菌学或PCR检查，可提高Mtb检出率，但该方法属于侵入性操作，既增加了患儿的痛苦又对临床实施的各方面要求较高，目前在我国难以作为儿童肺结核常规诊断方法，尤其是不适合用于临床疑似肺结核患儿的初步筛查。2008年，Wolf等［7］对236名怀疑肺结核的患儿进行了大量的侵入性检查，包括支气管灌洗和插胃管等，收集到超过2000份临床标本进行Mtb培养，最终只有16名患儿培养结果为阳性，初筛阳性率极低。

2003年，Montenegro等［8］研究发现肺结核患者粪便标本中可检测到Mtb-DNA，说明Mtb核酸经过肠道转运后仍可保持完整。本研究采用试剂盒快速提取粪便样本中总DNA和FQ-PCR扩增Mtb种属特异性IS6110核酸片段的方法，最终实验结果敏感度达到23．68%，特异度为100．00%。本研究中，76例粪便标本FQ-PCR检测发现阳性18例，阳性率23．68%，金胺O染色涂片检测阳性标本5例，阳性率仅为6．58%。粪便标本FQ-PCR检测阳性率明显高于涂片检测，该实验结果与2009年El Khéchine等［9］的相关报道是一致的。一方面说明了粪便标本采用FQ-PCR进行检测受干扰小，结果灵敏度较高；另一方面，由于Mtb涂片检查阳性率低于荧光PCR的检测［10］，同时也由于粪便中杂质较多，导致背景干扰较大，进一步降低了粪便涂片检查的阳性率，表明粪便标本涂片不适用于临床查Mtb。

本研究对痰细菌学检测阳性、痰细菌学检测阴性与无痰肺结核患儿的粪便标本的FQ-PCR检测结果进行了比较，还对同一患儿的粪便标本FQPCR检测结果与痰标本FQ-PCR检测结果进行了比较。经统计学分析可知，痰菌阳性肺结核患儿粪便标本FQ-PCR阳性率（66．67%）明显高于痰菌阴性组（3．85%）和无痰患儿组（20．00%）；同一患者的痰标本FQ-PCR检测阳性率（43．90%）也显著高于粪便标本PCR检测阳性率（26．83%），因此，粪便标本PCR检出率高于粪便涂片但低于痰涂片和（或）培养以及痰PCR，比较敏感。但是，76例结核病患儿中有35例（46．05%）只收集到粪便标本，经FQPCR检测发现了阳性7例。因此，虽然痰涂片加培养或者痰PCR检测优于粪便标本PCR检测，但粪便标本FQ-PCR检测结果对儿童结核病患者痰标本的细菌学和分子生物学检测结果是一个有益的补充。

本研究采用试剂盒提取粪便标本中DNA，快速高效，减少了粪便中PCR抑制剂对结果的干扰；采用FQ-PCR扩增技术，比普通PCR扩增加电泳检查又可大大提高检测的灵敏度。粪便检测结果阳性的患儿，不但可避免多次侵入性检查；而且，整个操作流程只需5～6h，速度远远高于Mtb培养所需的几个星期。同时，保留检测结果阳性的粪便标本DNA，还可进一步用于利福平、异烟肼等抗结核药物的耐药突变位点的检测。这些研究的证据都表明，粪便标本荧光实时PCR可以协助诊断小儿肺结核病。

总之，粪便荧光实时PCR是一种特异度高、中度敏感、非侵入性且相对安全快速的诊断方法，作为可疑儿童肺结核患者的一项初筛测试，可减少儿童结核病误诊的发生。随着DNA提取和PCR扩增技术的不断改进，其检测阳性率还可进一步提高。由于结果的高特异度，早期粪便荧光实时PCR检测还能帮助临床医生迅速找出肺结核患儿，并开始进行早期治疗。

［1］金彪，朱铭．儿童胸部影像学诊断．第9讲 儿童肺结核的影像诊断．中国实用儿科杂志，2004，19（9）：574-575．

［2］中国防痨协会基础专业委员会．结核病诊断实验室检验规程．北京：中国教育文化出版社，2006．

［3］纪洪新，邱建清，周峰．儿童结核病延误诊断原因分析．临床肺科杂志，2005，10（2）：238．

［4］中华人民共和国卫生部．2000年第四次全国肺结核病流行病学抽样调查．北京：人民卫生出版社，2003：1-52．

［5］Smith KC，Starke JR，Eisenach K，et al．Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens from children using a polymerase chain reaction．An Pediatrics，1996，97（2）：155-160．

［6］肖爱清，侯双翼，王文，等．聚合酶链反应技术检测儿童肺结核效果初探．中国热带医学，2003，3（2）：140-141．

［7］Wolf H，Mendez M，Gilman RH，et al．Diagnosis of pediatric pulmonary tuberculosis by stool PCR．Am J Trop Med Hyg，2008，79（6）：893-898．

［8］Montenegro SH，Gilman RH，Sheen P，et al．Improved detection of Mycobacterium tuberculosis in Peruvian children by use of a heminested IS6110polymerase chain reaction assay．Clin Infect Dis，2003，36（1）：16-23．

［9］El Khéchine A，Henry M，Raoult D，et al．Detection of Mycobacterium tuberculosis complex organisms in the stools of patients with pulmonary tuberculosis．Microbiology，2009，155（Pt 7）：2384-2389．

［10］吴驰，张红梅，詹能勇，等．荧光定量PCR技术在肺结核诊断中的临床应用研究．中国防痨杂志，2010，32（10）：647-650．