响应面法优化微波辅助提取贻贝蛋白的工艺研究

曹 川，包建强

（上海海洋大学食品学院，上海201306）

响应面法优化微波辅助提取贻贝蛋白的工艺研究

曹 川，包建强*

（上海海洋大学食品学院，上海201306）

研究微波对中性蛋白酶水解贻贝蛋白条件的影响，探讨了在一定的微波功率/时间，加酶量、酶解温度和时间对蛋白质回收率的影响。单因素实验先确定因素水平，再通过响应面确定最佳的工艺条件，酶解条件分别是时间为118.8min，加酶量为0.754%，微波功率为189.7W，温度分别为46.9℃，该条件下得到的最大蛋白质回收率为74.83%。

微波，酶法水解，贻贝

贻贝，俗称“海红”、“淡菜”等，是一种优质的海产养殖贝类，越来越受到公众的重视[1]。贻贝不仅具有很高的食用价值，还富含蛋白质，多聚不饱和脂肪酸、矿物质、维生素等营养物质，同时还具有抗疲劳、抗肿瘤、增强免疫力等保健功能[2]。微波技术最大的特点是缩短提取时间，提高效率，节约成本[3-4]。本实验利用微波辅助中性蛋白酶[5-6]水解贻贝蛋白，有提高蛋白质回收率、酶用量少等特点，可为贻贝蛋白资源的利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜贻贝 产自嵊泗贻贝养殖基地；风味蛋白酶 上海源叶生物科技有限公司；中性蛋白酶、福林试剂、三氯乙酸、甲醛等 均为分析纯，购于国药试剂有限公司。

NN-GD567M微波炉 上海松下微波炉有限公司；Kjeltel2300凯氏定氮仪 丹麦FOSS仪器有限公司；SZF06全自动粗脂肪测定仪 浙江托普仪器有限公司；ETO DENKI THERMIC MODEL 2100A热电偶测温仪，METTLER TOLEDO FIVEEASY酸度计等。

1.2 实验方法

1.2.1 制备提取液 称取5份50g经前处理的贻贝于烧瓶中，加150mL蒸馏水，加入中性蛋白酶混合均匀，调节pH（pH6.5），分别在不同微波功率及辐射时间组合条件下水解，利用热电偶测温仪监测，当酶解温度达到45℃，停止微波，取出后继续在45℃水浴下水解120min，经灭酶（95℃、10min），离心（9000r/min、20min）得上清液为贻贝蛋白水解产物，测定蛋白质回收率。

1.2.2 蛋白质回收率的测定[5]用凯氏定氮法分别测定上清液和酶解液中蛋白氮含量，并按下式计算：蛋白质回收率（%）=（上清液总蛋白氮量/原料总蛋白氮量）×100%

1.2.3 响应曲面设计 在单因素实验结果基础上，综合考虑4个因素对蛋白质回收率的影响，采用Box-Behnken设计方案做响应曲面研究，建立了贻贝蛋白提取率的二次多项式数学模型。4个自变量：酶解时间、加酶量、温度、微波功率分别以A、B、C、D代表，如表1所示。

表1 实验因素和水平表Table 1 Experimental factors and level table

2 结果与分析

2.1 单因素实验对蛋白质回收率的影响

2.1.1 微波功率对蛋白质回收率的影响 分别称取50g经前处理的贻贝于烧瓶中，加150mL蒸馏水，加入中性蛋白酶混合均匀，调节pH，分别在不同微波功率及辐射时间组合条件下水解，取出后继续在45℃下水解120min，经灭酶、过滤后，将滤液浓缩，测定蛋白质回收率。由图1可知，在微波功率从100W到200W时，蛋白质回收率是呈增加的趋势，当200W到300W蛋白质回收率呈下降趋势，在200/41（W/s）时达到最大值，因此认为微波功率为200W，对应的微波加热时间为41s时为最佳的实验条件。

图1 微波功率对蛋白质回收率的影响Fig.1 Effect of microwave power on the protein recovery rate

图2 酶用量对蛋白质回收率的影响Fig.2 Effect of enzyme concentration on the protein recovery rate

2.1.2 酶用量对蛋白质回收率的影响 分别称取50g经前处理的贻贝于烧瓶中，加150mL蒸馏水，分别按照0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的比例加入中性蛋白酶混合均匀，调节pH，在200W/41s微波功率及辐射时间组合条件下水解，取出后继续在45℃下水解120min，经灭酶、过滤后，将滤液浓缩，测定蛋白质回收率，结果如图2所示。从图2可以看出，随着加酶量的增加蛋白质回收率也是递增的，从0.20%到0.60%时增加迅速，从0.60%到1%是缓慢增加，加酶量的增加导致成本的增加，综合经济因素，0.60%是最佳的加酶量。

2.1.3 料液比对蛋白质回收率的影响 以1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5、1∶4的料液比，分别按照0.80%的比例加入中性蛋白酶混合均匀，调节pH，在200W/41s微波功率及辐射时间组合条件下水解，取出后继续在45℃下水解120min，过滤后，将滤液浓缩，测定蛋白质回收率，结果如图3所示。从图3可以看出，1∶2到1∶3是呈增加的趋势，1∶3到1∶4是呈下降趋势。1∶3是最佳的料液比，因为随着料液比的增大，酶活力不断增大达到最大值后就不变，因此蛋白质的回收率趋势是先上升再下降。

图3 料液比对蛋白质回收率的影响Fig.3 Effect of concentration on the protein recovery rate

2.1.4 水解温度对蛋白质回收率的影响 分别称取50g经前处理的贻贝于烧瓶中，加150mL蒸馏水，分别按照0.80%的比例加入中性蛋白酶混合均匀，调节pH，在200W/41s微波功率及辐射时间组合条件下水解，取出后分别在35、40、45、50、55℃水解120min，经灭酶、过滤后，将滤液浓缩，测定蛋白质回收率，结果如图4所示。从图4可以看出，35～45℃是呈增加的趋势，45～55℃呈下降的趋势，45℃时蛋白质的回收率达到最大值，45℃是最佳的酶解条件。酶活力在低温时被抑制，在高温时被破坏，在最适温度下酶活力达到最大。

图4 水解温度对蛋白质回收率的影响Fig.4 Effect of temperature on the protein recovery rate

2.1.5 水解时间对蛋白质回收率的影响 分别称取50g经前处理的贻贝于烧瓶中，加150mL蒸馏水，分别按照0.80%的比例加入中性蛋白酶混合均匀，调节pH，在200W/41s微波功率及辐射时间组合条件下水解，取出后分别在45℃水解60、120、180、240、300min，经灭酶、过滤后，将滤液浓缩，测定蛋白质回收率，结果如图5所示。由图5可以看出，随着时间的增加，蛋白质回收率递增，但是随着时间的增加，水解液的风味变化明显，会出现腥臭味，60～120min时增加迅速，120～300min时增长缓慢。所以认为120min时为最佳水解时间。

图5 水解时间对蛋白质回收率的影响Fig.5 Effect of time on the protein recovery rate

2.2 响应曲面优化实验

2.2.1 模型的建立及显著性检验 在不同微波功率及辐射时间组合条件下水解，利用热电偶测温仪监测，当酶解温度达到45℃，停止微波，因此不同微波对应时间固定，100W/83s、150W/64s、200W/41s、250W/30s、300W/22s。利用Design Expert 7.0程序对实验进行处理分析，回归方程的方差分析、各项的方差分析和参数估计及显著性分析的主要结果归纳分别见表3。 53017.98AB+6414.19AC+1433.25AD+13485.48BC+ 6758.13BD+29.71CD-1.851A2-1.318B2-2263.41C2-41.82D2

表2 响应面分析实验结果Table 2 Result of response

利用Design Expert 7.0软件对数据进行二次多元回归拟合微波辅助酶解贻贝蛋白方程：

Y=-26.47+2329.05A+3659.68B+834.94C-3.79D-

表3 回归方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

二次回归模型的F值12.14，P值＜0.0001，大于在0.01水平上的F值，而缺失项的F值为3.81，小于在0.05水平的F值，说明该模型拟和结果好，一次项、二次项和交互项的F值均大于0.01水平上的F值，说明各个因素之间的交互作用都对回收率有极其显著的影响。利用SAS软件进行分析，蛋白质回收率最高时的条件是时间、加酶量、温度和微波功率分别为118.8min、0.754%、46.9℃、189.7W，该条件下得到的最大蛋白质回收率为74.83%。

2.2.2 响应面分析 利用Design Expert 7.0软件对表2数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应曲面见图6～图11。

由图6可知，B（加酶量）不变的条件下，固定A提取时间，曲线呈现先增高后降低的较陡的曲线，由图7可知，在C（温度）不变的条件下，固定A（提取时间），曲线呈先增加后递减的规律。由图6、图7、图9响应面图形可知，等高线都为椭圆形，说明时间和加酶量、时间和温度以及温度和加酶量两两之间的交互作用明显，都对蛋白质的回收率有影响。

图6 时间和加酶量对蛋白质回收率的影响Fig.6 Effect of temperature and enzyme concentration on the protein recovery rate

图7 温度和时间对蛋白质回收率的影响Fig.7 Effect of temperature and time on the protein recovery rate

图8 微波功率和时间对蛋白质回收率的影响Fig.8 Effect of microwave power and time on the protein recovery rate

图9 温度和加酶量对蛋白质回收率的影响Fig.9 Effect of temperature and enzyme concentration on the protein recovery rate

图10 微波功率和加酶量对蛋白质回收率的影响Fig.10 Effect of microwave power and enzyme concentration on the protein recovery rate

图11 微波功率和温度对蛋白质回收率的影响Fig.11 Effect of microwave power and temperature on the protein recovery rate

由图8可知，在D（微波功率）固定的条件下，A（提取时间）不变的情况下，贻贝蛋白的回收率曲线呈现先陡峭增加后平滑递减的规律，说明在开始时微波功率的增大对蛋白质回收率的影响较大。由图8、图10、图11可知，贻贝蛋白的回收率是先增加后降低，等高线的形状反映出微波功率与酶解时间、加酶量、温度之间的交互作用的较弱，响应面比较陡峭说明蛋白质回收率对时间、加酶量、温度、微波功率的变化敏感[7-9]。

2.3 模型验证

为检验响应曲面法的可靠性，采用上述优化条件进行实验，对实验结果进行验证。考虑到实际操作的便利，将酶解工艺参数进行修正：时间为119min，加酶量为0.75%，微波功率为190W，温度为47℃。该条件下得到的最大蛋白质回收率为74.53%、74.15%、74.29%、74.65%、74.47%，平均值为74.418%，偏差不大，证明该结果是合理可靠的。

3 结论

蛋白质回收率与4个关键因子（酶解时间、加酶量、温度、微波功率）的二次多项回归模型，经过验证是合理可靠的，同时利用响应面对关键因子及其相互作用进行了分析，得出最佳酶解条件分别是：时间为118.8min、加酶量为0.754%、微波功率为189.7W、温度为46.9℃，该条件下得到的最大蛋白质回收率为74.83%左右。该研究可以为有效科学地酶解贻贝蛋白提供重要的技术基础。

[1]Guérard F，Dufossé L.Enzymatic protein recovery rate of proteins from yellowfin tuna（Thunnus albacares）wastes using Alcalase[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2001，11（4-6）：1051-1059.

[2]郭玉华，李钰金，吴新颖.贻贝食品的研究进展[J].肉类研究，2009（5）：84-87.

[3]曹光辉，黄诚，尹红，等.微波辅助酶法水解草鱼鱼鳞的工艺条件[J].吉首大学学报：自然科学版，2010（2）：101-104.

[4]郑利琴，张憨，孙金才，等.微波与超声波提取杨梅汁多酚类物质的对比研究[J].食品与生物技术学报，2010（4）：514-517.

[5]Bhaskar N，Benila T，Radha C，et al.Optimization of enzymatic hydrolysis of visceral waste proteins of Catla for preparing protein hydrolysate using a commercial protease[J].Bioresource Technology，2008，99（2）：335-343.

[6]兰时乐，戴小阳，胡超，等.酶法水解鲢鱼蛋白的研究[J].食品研究与开发，2009（7）：45-48.

[7]吴华勇，黄赣辉，顾振宇，等.响应曲面法优化竹叶总黄酮的提取工艺研究[J].食品科学，2008，29（11）：196-200.

[8]刘春泉，刘玉花，李建军，等.响应曲面法优化速冻紫甘薯的烫漂工艺[J].江苏农业学报，2009，25（4）：880-884.

[9]Liu J C，Shu M，Wen X C，et al.Optimization of polysaeeharides（ABP）extraction from the fruiting bodies of Agarieusblazei Mmillusing response surfae methodology[J].Carbohydrate Polymers，2009，78（2）：704-709.

Study on optimization of microwave-assisted hydrolization of mussels using response surface methodology

CAO Chuan，BAO Jian-qiang*
（Shanghai Ocean University，College of Food Science，Shanghai 201306，China）

The impact of microwave extraction technique on neutrase hydrolyzing mussel was investigated. Under certain conditions of microwave power/radiation time，enzyme concentration，enzyme temperature and time influence recovery of hydrolysis has been discussed.The best extraction process conditions were determined by preferable level of factor which was decided by univariate test as well as response surface methodology.The results showed that the best conditions of enzyme hydolyzing mussel were：time was 118.8min，neutrase concentration was 0.754%，microwave power was 189.7W，temperature was 46.9℃，the hydrolization rate could reach 74.83%.

microwave；enzyme hydrolization；mussel

TS254.1

B

1002-0306（2012）05-0258-04

2011－05－31 *通讯联系人

曹川（1988－），女，硕士研究生，研究方向：食品冷冻。

上海市教育委员会重点学科建设项目（J50704）。