薄膜-超声法制备二氢杨梅素脂质体的工艺研究

熊 伟，李雄辉，胡居吾，涂招秀，季清荣

（江西省科学院应用化学研究所，江西南昌330029）

薄膜-超声法制备二氢杨梅素脂质体的工艺研究

熊 伟，李雄辉*，胡居吾，涂招秀，季清荣

（江西省科学院应用化学研究所，江西南昌330029）

采用薄膜-超声法，对二氢杨梅素脂质体的制备工艺进行了研究，通过单因素和响应面实验确定了最佳工艺参数：卵磷脂和胆固醇比为6.2∶1（g∶g），卵磷脂和二氢杨梅素比为4.1∶1（g∶g），超声时间为34min，缓冲液pH为7.0，在此条件下，二氢杨梅素脂质体的包封率为88.58%。此法制备二氢杨梅素脂质体具有操作简便可行，脂质体包封率高、稳定性好等优点。

二氢杨梅素，脂质体，响应面法，制备，包封率

藤茶，系葡萄科蛇葡萄属中的一种野生藤本植物，其味甘淡、性凉，夏天泡茶多日不馊，有神茶之称。近代医学研究表明，藤茶及其提取物具有抑菌、降血脂、降血压、抗氧化、降血糖、保肝护肝以及减轻乙醇中毒等功效[1-7]。藤茶的主要活性成分为黄酮类化合物，并以二氢杨梅素的含量为最高，此外还含有部分杨梅素等其它成分[8-10]。二氢杨梅素易溶于丙酮、乙醇、热水，但脂溶性差、生物利用度低、易被氧化，这大大限制了其在医药和食品等行业的应用。脂质体作为药物载体，是一种相对较新的微胶囊化技术，具有保护被包裹药物、防止药物氧化、提高药物稳定性、提高被包裹药物生物利用度、使被包裹药物具有靶向性、天然无毒、生物可降解、无免疫抑制作用等优点[11-13]。目前，国内外尚无任何关于二氢杨梅素脂质体的相关报导。有效成分的包封率和稳定性是评价脂质体的主要质量指标。本实验采用薄膜-超声法首次尝试将二氢杨梅素制备成脂质体，以二氢杨梅素的包封率为考查指标，并以响应面分析法对影响脂质体包封率的脂材比例、pH、超声时间等条件进行优化，并对二氢杨梅素脂质体的稳定性进行研究，旨在为二氢杨梅素脂质体的制备提供参考，为二氢杨梅素系列产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藤茶 江西抚州黎川，60℃干燥24h备用；二氢杨梅素对照品 中国药品生物制品检定所；大豆卵磷脂、胆固醇 南昌绿恒科技有限公司进口分装；无水乙醇、乙醚、曲拉通X-100、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾 天津永大化学试剂厂，分析纯；甲醇 江苏汉邦有限责任公司，色谱纯；三蒸水 自制。

Agilent1100型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；RE52CS型旋转蒸发仪，SHZ-Ⅲ型循环水真空泵 上海亚荣生化科技有限公司；TD-5A型离心机 上海安亭科学仪器厂；PHS-3C型精密pH计 上海精密科学仪器有限公司；JM-10002型电子天平 余姚市纪铭称重校验设备公司；KQ200型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 二氢杨梅素的制备 准确称取200g藤茶干叶后，粉碎至80目过筛，按照1∶25的料液比添加水，在95℃下提取120min后，趁热过滤，冷却后静置24h，过滤，干燥得粗提物；将粗提物加丙酮回流提取2次，料液比分别为1∶5和1∶3，合并提取液后浓缩至小体积，慢慢加水沉淀，直至产生大量晶体，将此晶体用水按1∶50料液比进行重结晶，重结晶5次后得到二氢杨梅素产品，HPLC检测其纯度为95%。

1.2.2 二氢杨梅素脂质体的制备 精密称取一定比例的卵磷脂、胆固醇和95%的二氢杨梅素，将二氢杨梅素溶于无水乙醇，卵磷脂、胆固醇用适量乙醚溶于圆底蒸发瓶中，两样混合振摇均匀，于旋转蒸发仪上50℃减压蒸发至瓶壁成透明薄膜，然后加入适量磷酸盐缓冲液将膜洗下，固定超声功率200W，在常温水浴中超声一定时间，依次过0.80μm和0.45μm滤膜，即得均匀的脂质体混悬液样。分别考虑不同卵磷脂和胆固醇比、卵磷脂和二氢杨梅素比、超声时间、缓冲液pH对二氢杨梅素脂质体包封率的影响，实验方法如下：

在卵磷脂和二氢杨梅素比为6∶1（g∶g），超声时间为20min，缓冲液pH为6.5时，分别取卵磷脂和胆固醇比例为1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1，考虑不同卵磷脂和胆固醇比对二氢杨梅素脂质体包封率的影响。

在卵磷脂和胆固醇比为6∶1（g∶g），超声时间为20min，缓冲液pH为6.5时，分别取卵磷脂和二氢杨梅素比例为2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1，考虑不同卵磷脂和二氢杨梅素比对二氢杨梅素脂质体包封率的影响。

在卵磷脂和胆固醇比为6∶1（g∶g），卵磷脂和二氢杨梅素比为4∶1（g∶g）、超声时间为20min，分别取缓冲液pH为6、6.5、7、7.5、8，考虑不同缓冲液pH对二氢杨梅素脂质体包封率的影响。

在卵磷脂和胆固醇比为6∶1（g∶g），卵磷脂和二氢杨梅素比为4∶1（g∶g）、缓冲液pH为7，分别取超声时间为10、20、30、40、50min，考虑不同超声时间对二氢杨梅素脂质体包封率的影响。

1.2.3 二氢杨梅素脂质体制备工艺的优化 综合前面单因素实验结果，采用响应面法对结果进行优化，根据Box-Behnken实验设计原理，选取脂醇比、脂药比、超声时间三个对包封率影响较为显著的因素，采用三因素三水平的响应面分析方法，实验因素水平表见表1。

表1 实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4 包封率的测定

1.2.4.1 色谱条件 采用HPLC法检测[14-16]。操作条件：色谱柱：C183.5×150mm；流动相：甲醇∶水∶磷酸＝27∶73∶0.1；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；检测波长：290nm；进样量：20μL。具体操作方法为：准确称取二氢杨梅素对照品2.5mg，溶于甲醇中，并准确定容至25mL作为母液，然后依次取0.2、0.4、0.6、0.8、1mL样液至10mL容量瓶中，以甲醇稀释至刻度，作为不同浓度的标准溶液，微孔滤膜过滤后进行测定，以色谱峰面积为横坐标，标准溶液浓度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4.2 包封率的测定方法 取400μL二氢杨梅素脂质体样品，用三蒸水稀释后，3000r/min转速下离心30min。取上清液进样测定游离二氢杨梅素含量，乘以稀释倍数得游离二氢杨梅素浓度C1。另取相应等量样品400μL，加入10%triton X-100溶液进行破乳，加水稀释同样倍数，测定二氢杨梅素含量，乘以稀释倍数得到脂质体中二氢杨梅素总浓度C2，则包封在脂质体内二氢杨梅素浓度C0=C2-C1。根据EE（%）=C0/ C2×100%，可计算出包封率（EE，%）。

1.2.5 稳定性考察 将二氢杨梅素脂质体分装在玻璃瓶中，于室温下和4℃冰箱中分别贮藏0、5、10d后，每次取3小瓶检测其包封率，并取其平均值，以此考察脂质体的稳定性。

2 结果与讨论

2.1 二氢杨梅素脂质体的制备工艺

2.1.1 不同比例的卵磷脂和胆固醇对包封率的影响胆固醇能够调节卵磷脂的凝聚结构，改变膜的通透性，还能影响脂质体的相变温度，进而引起包封率的变化。但胆固醇含量太高，组成脂质体的磷膜量太少，会使脂质体膜形成困难且不牢固。不同比例的卵磷脂和胆固醇对脂质体包封率的影响见图1。由图1可知，随着加入磷脂量的增多，包封率先提高后降低，当卵磷脂和胆固醇比例为6∶1（g∶g）时，脂质体的包封率最高。

图1 不同比例的卵磷脂和胆固醇对包封率的影响Fig.1 Effect of different proportion of phosphatidylcholine and cholesterol on the encapsulation

2.1.2 不同比例的卵磷脂和二氢杨梅素对包封率的影响 制备二氢杨梅素脂质体时，卵磷脂与二氢杨梅素比例不同，对包封率有明显影响。二氢杨梅素加入量太多，超过了脂质体能包埋的最大量，会导致脂质膜难以形成。二氢杨梅素加入量太少，则造成卵磷脂利用度不高。不同比例的卵磷脂和二氢杨梅素对包封率的影响见图2。由图2可知，随着脂药比的增大，包封率先提高后降低，当卵磷脂和二氢杨梅素比例为4∶1（g∶g）时，包封率最高。

图2 不同卵磷脂和二氢杨梅素比对包封率的影响Fig.2 Effect of ratio of phosphatidylcholine to dihydromyricetin on the encapsulation

2.1.3 不同pH缓冲液对包封率的影响 不同pH缓冲液对包封率的影响见图3。由图3可以看出，磷酸盐缓冲液的pH从6.0变化到8.0的过程中，脂质体包封率先提高后降低，并在7.0时包封率达到最大，但总体而言pH对脂质体包封率的影响并不大。包封率的下降可能是因为随着pH的升高，使得二氢杨梅素中酚羟基的氢离子更容易电离，从而导致二氢杨梅素更容易以离子形态存在于脂质体悬液中。

图3 不同pH缓冲液对包封率的影响Fig.3 Effect of buffer solution pH on the encapsulation

2.1.4 不同超声时间对包封率的影响 超声会使脂质体混悬液中粒径大的多室脂质体转化为较均匀的小粒径单室脂质体，使体系更为稳定。由图4可知，随着超声时间的不断延长，包封率先提高后降低，这可能是因为超声时间过长会引起磷脂相变，破坏脂质体的结构，使包封的二氢杨梅素泄露，从而降低包封率。而时间太短，包封率虽大，但体系不够均匀稳定。因此，超声30min左右时，包封效果较好。

图4 不同超声时间对包封率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the encapsulation

2.2 二氢杨梅素脂质体的制备工艺的优化

响应面实验方案及实验结果见表2，回归模型方差分析见表3。本方案共设15个实验点，其中12个分析因子，3个零点以估计实验误差，各实验点以随机顺序进行，重复实验3次，取其平均值。

表2 实验方案及实验结果Table 2 Design and results of experiments

表3 回归模型方差分析Table 3 ANONA（analysis of variance）of regression equation

各因素经回归拟和后，得到回归方程为：

式中，Y为二氢杨梅素包封率（%），X1为脂醇比（g∶g），X2为脂药比（g∶g），X3为超声时间（min）。

当“Pr＞F”值小于0.01即表示该项指标显著，从表3的分析结果可知，整体模型的“Pr＞F”小于0.01，而且方程的失拟项不显著，表明该二次方程高度拟合，实验误差小，因此可用该回归方程代替实验点对实验结果进行分析和预测。根据模型对制备工艺的最佳工艺条件进行预测：当脂醇比为6.19∶1，脂药比为4.06∶1，超声时间为33.36min，在此条件下，二氢杨梅素的包封率理论上可达88.97%。考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为：脂醇比为6.2∶1，脂药比为4.1∶1，超声时间为34min，在此条件下进行三次平行实验取平均值，检测二氢杨梅素的包封率为88.58%，与理论预测值基本相符。

根据回归方程，做出响应面图，分析脂醇比、脂药比、超声时间对二氢杨梅素脂质体的影响。图5～图7直观地反映了各因素对包封率的影响，比较三组图可知，超声时间对包封率影响最为显著，表现为曲线较陡；而脂醇比和脂药比则影响不显著，表现为曲线较为平滑。这与表3中各影响因素对包封率影响大小次序（超声时间＞脂醇比＞脂药比）一致。

图5 脂醇比和脂药比对包封率影响的响应面图Fig.5 Effect of ratio of phosphatidylcholine to cholesterol and phosphatidylcholine to dihydromyricetin on the encapsulation

图6 脂醇比和超声时间对包封率影响的响应面图Fig.6 Effect of ratio of phosphatidylcholine to cholesterol and ultrasonic time on the encapsulation

图7 脂药比和超声时间对包封率影响的响应面图Fig.7 Effect of ratio of phosphatidylcholine to dihydromyricetin and ultrasonic time on the encapsulation

2.3 二氢杨梅素脂质体的稳定性

由表4可知，随着贮藏时间的延长，二氢杨梅素脂质体的包封率并无显著变化，显示出良好的稳定性。比较二氢杨梅素脂质体在4℃和常温条件下贮藏结果可知，二氢杨梅素脂质体在4℃条件下表现出更好的稳定性。

表4 二氢杨梅素脂质体的稳定性实验Table 4 The stability experiments of dihydromyricetin liposome

3 结论

3.1 采用薄膜－超声法将二氢杨梅素制备成脂质体，并借助响应面分析法得到与实际拟和程度较高的模型及优化工艺条件：卵磷脂和胆固醇比为6.2∶1（g∶g），卵磷脂和二氢杨梅素比为4.1∶1（g∶g），超声时间为34min，缓冲液pH为7.0，在此条件下，二氢杨梅素脂质体的包封率为88.58%。

3.2 薄膜－超声法制备二氢杨梅素脂质体具有操作简便可行，脂质体包封率高、稳定性好等优点，因此，具有良好的应用前景。

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Study on the dihydromyricetin liposome preparation by membrane-ultrasonic method

XIONG Wei，LI Xiong-hui*，HU Ju-wu，TU Zhao-xiu，JI Qing-rong
（Institute of Applied Chemistry，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang 330029，China）

The membrane-ultrasonic method was used to prepare dihydromyricetin liposome.The optimum conditions were determined by the single factor and response surface tests：the phospholipid∶cholesterin was 6.2∶1，the phospholipids∶dihydromyricetin was 4.1∶1，the ultrasonic time was 34min，the buffer solution pH was 7.0.Under the optimum conditions，the encapsulation efficiency was 88.58%.Preparation of dihydromyricetin liposome by membrane-ultrasonic method was simple and feasible，it had high encapsulation efficiency and good stability.

dihydromyricetin；liposome；response surface method；preparation；encapsulation efficiency

TS201.2

B

1002-0306（2012）05-0254-04

2011－06－09 *通讯联系人

熊伟（1982-），男，硕士研究生，助理研究员，研究方向：天然产物提取分离与分子修饰。

江西省重大科技攻关项目（2007BN21000）。