北京地区健康肉鸡携带沙门氏菌状况调查

张纯萍，宁宜宝，宋 立，陈惠娟，习 硕，袁 欣

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081;2.扬州大学，江苏扬州 225009;3.北京农学院，北京 102206)

沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原微生物，它不仅能够引起鸡的各种疾病，而且感染鸡耐过后经常成为隐性带菌者，不定期排毒，从而感染其他鸡只并污染周围环境，对肉鸡的养殖造成很大危害。更为重要的是，肉鸡所携带的沙门氏菌也是一种重要的食源性病原菌。研究［1-2］表明，人感染肠炎沙门氏菌主要是由于食用了被污染的禽蛋和禽肉所引起。

沙门氏菌血清型众多，目前已经鉴定出2500多种血清型。不同国家、不同地区鸡群中的优势血清型不同，不同血清型的沙门氏菌对鸡和人的致病性也不相同。全球食源性监测网的检测结果表明［3］，引起公共卫生安全的沙门氏菌主要以肠炎和鼠伤寒两种血清型为主。肉鸡作为人肠炎沙门氏菌感染的主要来源，美国和欧盟等西方发达国家早在20世纪90年代就已经开展了对食品动物中沙门氏菌病流行性的调查，而且每年都会发布监测结果报告;欧盟还制定了肉鸡肠炎沙门氏菌的严格控制措施和控制目标［4-5］，但目前国内对肉鸡中沙门氏菌流行状况的研究和调查资料很少。鉴于此，本研究从2010年4月至2011年10月期间共采集北京地区28个肉鸡养殖场的健康肉鸡盲肠或泄殖腔拭子样品1310份，分离其中的沙门氏菌并进行血清型鉴定，以了解北京地区健康肉鸡沙门氏菌的携带情况，从而为北京地区肉鸡场沙门氏菌病的防控和首都的公共卫生安全提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 待宰肉鸡泄殖腔拭子或屠宰场肉鸡的盲肠样品共1310份，分别采自北京市顺义、海淀、怀柔、延庆、平谷等区县28个肉鸡养殖场的健康肉鸡(41～49日龄)，其中每个肉鸡养殖场采样40～50份。样品采集后4 h内分离沙门氏菌。

1.1.2 培养基 亚硝酸盐胱氨酸(SC)、沙门氏菌显色培养基和XLT4培养基均购自青岛高科园海博生物技术有限公司;四硫磺酸钠煌绿(TTB)购自英国Oxoid公司;营养琼脂由中国兽医药品监察所提供。

1.1.3 沙门氏菌诊断血清(全套193支) 购于泰国S＆A公司。

1.1.4 分子试剂 PCR buffer、dNTP和 GoTaq DNA聚合酶均由普洛麦格(北京)生物技术有限公司提供;DL2000 DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.5 引物合成与测序 分别由英俊生物技术有限公司北京合成部和北京测序部完成。

1.2 方法

1.2.1 沙门氏菌的分离与鉴定 根据本实验室建立的方法［6］进行沙门氏菌的分离，具体为：将泄殖腔拭子或者盲肠样品用SC和TTB增菌液进行常规增菌培养，然后分别取1环增菌液划线接种于沙门氏菌显色培养基和XLT4培养基37℃培养过夜，可疑菌落用营养琼脂进一步纯化。

纯化后的菌落用PCR方法［7］进行鉴定。扩增目的片段invA基因的长度为284 bp，上下游引物(5'-3')分别为：gtg aaa tta tcg cca cgt tcg ggc aa和tca tcg cac cgt caa agg aac c，反应条件为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环;最后72℃延伸5 min。PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳后进行凝胶成像分析。

1.2.2 沙门氏菌的血清分型 将沙门氏菌接种营养琼脂平板，37℃培养过夜后根据泰国血清的操作说明和国标中沙门氏菌的检验方法［8］分别进行菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原的检测，以生理盐水作为阴性对照，与试验抗血清出现凝集反应者即判定为阳性。根据O抗原和H抗原的检测结果，参照沙门氏菌属抗原表［9］判定血清型，记录结果。

2 结果

2.1 沙门氏菌的分离鉴定结果 本研究总共从1310份样品中分离鉴定出沙门氏菌54株，总分离率为4.1%。不同养殖场沙门氏菌的分离情况不同，在所采样的28个肉鸡养殖场中，仅从其中的15个养殖场(53.6%)分离到了沙门氏菌，而其余13个养殖场(46.4%)均未分离到沙门氏菌，这15个沙门氏菌阳性肉鸡场的分离情况见表1。由表1可见，15个沙门氏菌阳性肉鸡场中沙门氏菌的携带情况差异很大，携带率在2.0% ～16.0%之间。

表1 15个阳性肉鸡场沙门氏菌的分离情况和血清分型结果

2.2 沙门氏菌的血清分型 15个阳性肉鸡场沙门氏菌的血清型分布见表1。由表1可知，不同肉鸡养殖场沙门氏菌的血清型分布不同，但是大多数肉鸡养殖场中分离的沙门氏菌均集中于1～2个血清型。总体来看，在所分离的54株沙门氏菌中，肠炎(S.enteritidis)(31.5%)和爪哇安那(S.javiana)(25.9%)为两种优势血清型，其次是禽伤寒(S.gallinarum)(9.3%)和马流产(S.abortusequi)(5.6%)沙门氏菌。本研究尚分离到6株II型(萨拉姆亚种，即S.enterica subsp.salamae)和5株不可分型的沙门氏菌。

3 讨论

3.1 健康肉鸡沙门氏菌的携带情况 根据北京地区肉鸡养殖场的分布情况，本研究共调查了该地区具有代表性的28个养殖场健康肉鸡体内沙门氏菌的流行情况，并从其中15个养殖场中分离到了沙门氏菌。总体来看，本研究中健康肉鸡沙门氏菌的平均携带率为4.1%，阳性肉鸡养殖场的平均分离率为7.4%，这与其他国家的研究结果相似。欧盟27个成员国在2009年和2010年对肉鸡进行的沙门氏菌监测结果表明，其平均带菌率分别为5.0%和4.1%［10］;越南对302份肉鸡粪便样品进行沙门氏菌的检测，发现沙门氏菌的携带率为7.9%［11］。

本研究中不同养殖场的分离率之间存在较大偏差，这说明健康成鸡体内沙门氏菌的携带情况与养殖场的饲养管理密切相关［1］。由于禽伤寒、肠炎等血清型的沙门氏菌可通过种鸡垂直传播，因此该分离结果也可能与种鸡的沙门氏菌携带以及种蛋的污染情况直接相关。欧盟的研究结果表明，2009年和2010年平均分别有2.4%和1.6%的父母代肉种鸡感染了沙门氏菌［10］，在我国虽然没有具体的感染率调查报道，但是种鸡与种蛋的沙门氏菌污染水平也不容忽视。

3.2 沙门氏菌的血清型分布 从种属关系来分，沙门氏菌可以分为邦戈尔和肠道两个种，肠道沙门氏菌又分为以下6个亚种：肠道亚种、萨拉姆亚种、亚利桑那亚种、双相亚利桑那亚种、浩敦亚种和因迪卡亚种。根据沙门氏菌菌体(O)抗原、荚膜(Vi)抗原和鞭毛(H)抗原的不同，又可将沙门氏菌分为许多血清型。2007年的WHO抗原表［9］中已经包含2579种血清型，其中绝大多数为肠道沙门氏菌(仅有22种属于邦戈尔沙门氏菌)。在2557种肠道沙门氏菌中，仅肠道亚种具有具体的血清型名称(1531个血清型)，其余5个亚种的血清型均以亚种名称表示。在本研究中，除了11株沙门氏菌(5株不可分型和6株II型)外，其余从健康肉鸡体内分离的沙门氏菌均属于肠道亚种。

本研究中不同养殖场沙门氏菌的血清型分布不同，但是整体来看，最常见的为肠炎沙门氏菌，这与大多数国家所分离到的优势血清型基本一致。美国2010年从肉鸡中分离的沙门氏菌主要以肠炎和肯塔基血清型为主［12］;而欧盟2010年分离的主要血清型为肠炎和鸭沙门氏菌［10］。本研究中位居第2的血清型为爪哇安那，占比25.9%，这与越南2001年的沙门氏菌血清型检测结果［11］类似，但是在美国和欧盟流行性位居前10的沙门氏菌血清型中均未发现该血清型，因此爪哇安那沙门氏菌的携带可能具有地区性的特点。

研究表明，在大多数国家，90%以上的沙门氏菌都属于30种左右的血清型［3］，但是近年来有些很少见的血清型又有增加的趋势［13］。在本研究中，除II型和不可分型的沙门氏菌外，共分离到8个血清型的沙门氏菌;并且大多数肉鸡养殖场中分离的沙门氏菌均集中于1～2个血清型，这可能与养殖场长期持续存在该血清型的感染或者种鸡来源相关。由于不同地区沙门氏菌的血清型分布差异很大，因此非常有必要对全国不同地区肉鸡沙门氏菌的血清型分布进行系统详细的监测，以了解全国肉鸡沙门氏菌的携带情况。

本研究调查了北京地区健康肉鸡体内沙门氏菌的携带情况，为开展全国性的沙门氏菌流行病学调查研究打下了良好的基础，并为北京地区肉鸡场沙门氏菌病的防控和公共卫生安全提供了资料和技术支持。

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