猪伪狂犬病灭活疫苗(HB-J株)对兔与猪免疫攻毒保护平行关系研究

舒银辉，黄文辉，饶清宜，郑良益，漆世华，吴玉石，杨思谊，杨 雷，谢红玲

(武汉中博生物股份有限公司，武汉 430070)

猪伪狂犬病是一种由伪狂犬病毒引起的高死亡率的急性传染病。猪伪狂犬病毒可侵害各种日龄阶段的猪，病毒可引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎，哺乳仔猪出现神经症状、体温升高、食欲下降、精神沉郁等不同程度临床症状，且耐过后常出现生长阻滞。该病是危害我国规模养猪业最严重的疫病之一。猪伪狂犬病病毒的持续性感染和潜在的免疫抑制，对于猪的疾病防治工作带来了很大困难。疫苗接种是防控猪伪狂犬病最主要、最经济的措施。本研究以猪伪狂犬病水包油佐剂灭活疫苗免疫兔和仔猪，并于免疫后一定时间攻击强毒，比较疫苗对兔和仔猪的免疫效力，从而探讨用实验动物兔进行猪伪狂犬病灭活疫苗效力检验的质控替代方法［1］。

1 材料与方法

1.1 疫苗 猪伪狂犬病灭活疫苗(HB-J株)为水包油佐剂灭活疫苗，每毫升疫苗中抗原含量为107.4 TCID50，疫 苗批 号 20100301、20100302 和20100303，由武汉中博生物股份有限公司制备。

1.2 效检用强毒 猪伪狂犬病毒PRV HB-J株，病毒含量为 108.5TCID50/mL，对兔毒力为 106.0LD50/mL，由武汉中博生物股份有限公司鉴定与保存。

1.3 试验动物及其攻毒发病判定标准 兔，2.5～3.0 kg，75只，普通级，购自武汉生物制品研究所。断奶仔猪，21～28日龄，75头，来自非免疫健康猪群，经检测PRV中和抗体效价均不高于1∶2，购于武汉新和畜牧养殖场。

仔猪攻毒发病判定标准：以下述(1)、(2)、(3)三项中出现任意两项，即判定为发病。(1)有精神沉郁、和/或腹泻、和/或食欲减退、和/或呼吸道症状等临床表现;(2)体温≥40.5℃，且持续48 h以上;(3)相对日增重下降10%。

兔攻毒发病判定标准：发痒(啃咬接种部位)、死亡两项中出现任意一项，即判定为发病。

1.4 血清中和抗体检测 即采用血清中和试验中的中和指数测定方法进行。将PRV HB-J株病毒液作10倍系列稀释，分装到两列无菌试管中，第一列加等量正常血清(对照组)，第二列加待检血清(试验组)，混合均匀后于37℃中和作用1 h，然后分组每个稀释度分别接种4孔已形成良好单层的BHK-21细胞，继续置37℃、5%CO2培养箱中培养，连续观察5 d。记录每组BHK-21细胞的细胞病变数，分别计算两组的组织细胞半数感染量(TCID50)，按照公式(中和指数=试验组TCID50/对照组TCID50)分别计算各待检血清中和指数。

1.5 疫苗对兔免疫攻毒保护试验 随机抽取猪伪狂犬病灭活疫苗若干瓶，每批疫苗用兔25只，分为5组，每组5只，其中第1、2、3组为免疫组，第4、5组为对照组。第1、2、3组分别臀部皮下注射0.5、1.0、2.0 mL/只，第4 组为攻毒对照组(仅攻毒不免疫)，第5组为正常对照组(不免疫不攻毒)。免疫后28 d采血并分离血清，用血清中和试验法(SN)检测血清中和指数［2］，记录检测结果。免疫后28 d进行攻毒，攻毒剂量为10 LD50/只。攻毒后逐日观察14 d，记录各组兔临床反应状况，并计算保护率。

1.6 疫苗对断奶仔猪免疫攻毒保护试验 每批疫苗用断奶仔猪25头，分为5组，每组5头，其中第1、2、3 组为免疫组，第 4、5 组为对照组。第 1、2、3组分别颈部肌肉注射 1.0、2.0、3.0 mL/头，第 4 组为攻毒对照组(不免疫只攻毒)，第5组为正常对照组(不免疫不攻毒)。免疫后28 d采血并分离血清，用血清中和试验法(SN)检测血清中和指数，记录检测结果。免疫后28 d进行攻毒，攻毒剂量为每头仔猪肌肉注射3 mL，并同时滴鼻3 mL。攻毒当日称重每头仔猪，攻毒21 d后再称重每头仔猪;攻毒后逐日观察21 d，记录各组动物临床反应情况。根据仔猪发病判定标准计算保护率。

2 结果

2.1 疫苗对兔免疫与攻毒保护试验结果 疫苗不同免疫剂量及其产生的抗体检测值如表1所示。兔免疫后28 d血清抗体采用中和试验法检测中和指数，3批疫苗0.5 mL免疫组中和指数检测值范围为794～2188，离散度(以变异系数CV的百分率表示)分别为 36.12%、32.69%、21.15%;1.0 mL 免疫组中和指数范围891～4677，离散度分别为75.02%、70.98%、50.01%;2.0 mL 免疫组中和指数范围 2188～14791，离散度分别为 53.27%、40.65%、51.10%;对照组中和指数均为 1(表 1)。免疫28 d攻毒，3批疫苗0.5 mL免疫组攻毒保护率分别为60%、80%、80%，1.0 mL免疫组攻毒保护率分别为80%、80%、80%，2.0 mL免疫组攻毒保护率分别为100%、100%、100%。攻毒对照组兔均出现发痒、舔咬接种部位等临床症状和临床表现，并最终5/5死亡;正常对照组5只兔全部健活(表2)。

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2.2 疫苗对仔猪免疫与攻毒保护试验结果 3批疫苗分别注射21～28日龄健康断奶仔猪，免后28 d测定血清中和抗体，1.0 mL免疫组中和指数检测值范围229～269，离散度(以变异系数CV的百分率表示)分别为 4.58%、4.58%、6.38%;2.0 mL 免疫组中和指数范围 398～589，离散度分别为14.42%、9.35%、9.18%，3.0 mL 免疫组中和指数范围447～724，离散度几何平均值分别为15.60%、20.84%、8.71%，对照组中和指数均为1(表1)。3批疫苗免疫后28 d攻毒，连续观察21 d，1 mL免疫组部分断奶仔猪在观察期间出现厌食、体温反应等不同程度发病症状，保护率分别为60%、60%、80%;2 mL和3 mL两个免疫组断奶仔猪在观察期间无任何不良反应，保护率均为100%。而攻毒对照组5/5仔猪在攻毒后3 d均出现体温反应(40.5 ～41.8 ℃)，且持续5 ～7 d，均伴有食欲减退现象，攻毒对照组发病率为100%(5/5)，正常对照组无任何不良临床反应(表2)。

2.3 疫苗对兔与猪免疫攻毒保护试验比较分析免疫后攻毒保护的对比试验结果见表2。疫苗以不同剂量免疫兔与断奶仔猪后，产生不同水平的血清抗体。以低剂量疫苗免疫兔与仔猪时，产生的血清抗体相对较低;以相对高剂量疫苗免疫兔与猪时，均产生较高水平的抗体。因此，免疫后相同对应时间，兔与猪血清抗体水平与疫苗免疫剂量呈现平行相关。

疫苗免疫28 d后攻毒，结合表1抗体检测值，抗体值较低者获得保护率相对较低，抗体值较高者获得保护率相对较高，兔与猪的血清抗体水平与攻毒后获得保护状况呈现平行相关关系。

3 小结

3.1 疫苗对兔免疫效力试验中，3种免疫剂量疫苗免疫后28 d产生的兔血清抗体中和指数0.5 mL免疫组中和指数为794～2188，1.0 mL免疫组中和指数为891～4677(每批疫苗的该免疫组中均有1只兔血清中和指数略低于1479)，2.0 mL免疫组中和指数为2188～14791，免疫组中血清抗体中和指数达到1479时可抵抗10 LD50剂量强毒的攻击，不出现死亡或者其他异常临床症状，0.5 mL免疫组保护率60% ～80%，1.0 mL免疫组保护率80%，2.0 mL免疫组保护率100%。试验结果表明，血清中和指数在794～1258之间能获得60%保护，中和指数≥1479时可获得100%保护，而攻毒对照组兔全部死亡(血清中和指数为1)。试验结果表明该疫苗能使兔产生良好的免疫应答反应［3］，且抗体产生水平高低与免疫剂量、攻毒保护呈现平行关系。

3.2 疫苗对仔猪免疫效力试验中，1.0 mL免疫组中和指数为229～269，2.0 mL免疫组中和指数为398～589，3.0 mL免疫组中和指数为447～724;攻毒后连续观察21 d，1 mL免疫组部分断奶仔猪在观察期间出现厌食、体温反应等不同程度发病症状，保护率为60% ～80%;2 mL和3 mL两个免疫组断奶仔猪在观察期间无任何不良反应，保护率均为100%;对照组均出现体温升高(≥40.5℃)并持续3 d以上、食欲减退、生长速度减缓等临床症状。各免疫组中血清抗体中和指数达到331时可抵抗强毒的攻击，无体温反应、食欲减退、生长速度减缓或其他异常临床症状。试验结果表明该疫苗能使猪产生良好的免疫应答反应，且抗体产生水平高低与免疫剂量、攻毒保护呈现平行关系。

综上所述，猪伪狂犬病灭活疫苗(HB-J株)对兔和断奶仔猪的免疫效力均良好，且疫苗对兔和断奶仔猪的免疫效力呈现良好的平行关系。考虑到检测成本以及动物福利等相关因素，在对猪伪狂犬病灭活疫苗(HB-J株)进行质量检验时，可使用兔替代本动物(猪)进行效力检验。

［1］张 莉，丁伯良，王英珍，等.家兔校验猪伪狂犬病灭活疫苗免疫效果的初步研究［J］.中国畜牧兽医，2009，36(5)：141-143.

［2］农业部兽用生物制品规程委员会.中华人民共和国兽用生物制品规程(二○○○年版)［M］.北京：化学工业出版社.2000：446-447.

［3］舒银辉，黄文辉，饶清宜，等.猪伪狂犬病不同佐剂灭活疫苗对兔免疫原性初探［J］.中国兽药杂志，2011，45(12)：19-22.