间充质干细胞对异体角膜移植大鼠CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞水平的影响△

贾 喆 张晓敏 赵少贞

角膜移植排斥反应主要是CD4+T细胞介导的细胞免疫应答[1]。目前，眼免疫调控和免疫赦免的大多数机制仍不清楚，尤其对于CD4+T细胞作为效应细胞如何发挥作用知之甚少，对于眼部免疫赦免机制的激活和调控仍需要进一步深入的研究。有研究表明CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)与前房相关免疫偏离的诱导相关[2]。Treg是不同于Th1和Th2的具有免疫调节功能的T细胞群体，其中CD4+CD25+Foxp3+Treg是Treg的重要亚群之一，在维持机体免疫耐受和免疫应答稳态方面具有重要作用。而Foxp3在CD4+CD25+Treg的产生和功能方面发挥重要的作用[3]。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能成体干细胞，具有多向分化潜能，能够支持造血和促进植入，具有免疫调控和促进组织损伤修复等功能，并具有易于获得以及性能稳定等优点[4]。其中MSC免疫调控作用的发现是近年来干细胞研究领域的一项重要突破。最新研究表明，MSC可以促进Treg的分化和增殖。我们前期研究表明在术后输注MSC可以通过抑制T细胞免疫应答和改变Th1/Th2应答平衡，显著抑制大鼠角膜移植排斥反应。本研究将在前期研究的基础上，通过建立大鼠角膜移植排斥动物模型，观察MSC对异体角膜移植排斥大鼠Treg的作用，进一步探讨MSC抑制角膜移植免疫排斥反应的机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组 选用12只成年雌性清洁级Wistar大鼠(体质量200～220 g)双眼角膜作为供体角膜植片，24只Lewis大鼠(体质量200～220 g)右眼作为受体植床，经裂隙灯和检眼镜检查屈光间质清晰，眼底无病变。饲养于天津医科大学动物实验中心。饲养环境通风良好，室温18～25℃，相对湿度40%～70%，12 h光照昼夜循环，环境符合医学实验动物环境设施要求。Lewis大鼠右眼选为术眼，以保证术后大鼠正常活动以及进食。将动物按序编号，用随机数字表法将Lewis大鼠随机分为治疗组和对照组，每组各12只。大鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，所有涉及到实验动物的实验程序都按照天津医科大学动物保护与使用委员会规定执行。

1.1.2 主要试剂 FITC标记的抗大鼠CD4单克隆抗体，PE标记的抗大鼠CD25单克隆抗体，荧光标记Foxp3抗体，及匹配的同型对照IgG(eBioscience公司，美国)。

1.2 角膜移植动物模型的制备及临床观察 参照文献[5]的方法建立同种异体穿透性角膜移植的大鼠模型:100 g·L－1水合氯醛 3 mL·kg－1腹腔注射麻醉;术前充分散瞳，眼结膜囊表面麻醉;显微镜下无菌操作，环钻钻取制作角膜植片(直径3.5 mm)和植床(直径3.0 mm);将植片植入植床，10-0尼龙缝线间断缝合8～10针，自然形成前房。术毕治疗组尾静脉输注MSC(5×106mL－1)1 mL，对照组输注等体积PBS。于术后第4天起每天行裂隙灯显微镜观察，记录排斥反应指数(rejection index，RI)，对角膜植片的透明度、水肿程度、新生血管3项指标进行评分[6]，当植片的3个参数之和 ≥5，或者植片混浊一项达到3时为免疫排斥发生。

1.3 CD4+CD25+Foxp3+Treg 检测

1.3.1 流式细胞学检测 穿透性角膜移植术后10 d时，2组分别抽取4只符合观察条件的受体大鼠处死，取脾脏，分离单个核细胞，加入4 μL CD4 FITC、4 mL CD25 PE，然后再加 IgG1同型对照4 μL。室温下孵育20 min，振荡后加1 mL红细胞裂解液，振荡，避光孵育 10 min，1500 r·min－1离心 6 min，弃上清，加PBS 2 mL，离心去上清，加入稀释好的荧光标记Foxp3抗体(用Permeabilization Buffer工作液进行稀释)20 μL，避光4℃孵育至少30 min，振荡重悬，1500 r·min－1离心 6 min，加 10 g·L－1的多聚甲醛0.5 mL，流式细胞仪检测。

1.3.2 脾脏 Foxp3 mRNA的表达 收集大鼠脾脏，分离单个核细胞，用Trizol提取总RNA，根据RTPCR试剂盒说明测定Foxp3 mRNA的表达水平。

1.4 统计学分析 实验数据应用SPSS 11.5统计软件进行分析处理，两组间比较应用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床观察 根据RI计分标准，术后10 d治疗组临床评分(4.00±0.63)分，显著低于对照组的(5.67 ±1.37)分(P ＜0.05)。

2.2 流式细胞学测定CD4+CD25+Foxp3+Treg水平 流式细胞学方法分析大鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg占 CD4+T细胞的百分比:治疗组为(6.25±0.35)%，较对照组的(5.45 ±0.38)%明显升高(P ＜0.05，见图1)。

2.3 RT-PCR检测Foxp3 mRNA的表达 RT-PCR结果显示，治疗组大鼠脾脏单个核细胞Foxp3 mRNA的相对表达量为5.65±0.45，显著高于对照组的2.13 ±0.74(P ＜0.05)。

3 讨论

3.1 大鼠角膜移植排斥模型建立的意义 因为角膜免疫赦免机制的存在[7-8]，与其他器官移植相比，角膜移植不易发生免疫排斥反应。角膜排斥反应主要发生于高危眼[9]。许多研究表明，在高危植床已发生了赦免机制的消除[10-11]，主要表现为维持角膜免疫赦免因素的消失和破坏[12]。本研究在供体、受体主要组织相容性抗原不同的近交系大鼠间(Wistar-Lewis)建立穿透性角膜移植模型[13]，模拟高危眼角膜移植排斥反应发生过程。前期研究发现，角膜移植对照组于术后10 d左右发生移植排斥反应，临床观察各模型发生排斥反应时间稳定一致。鉴于此，本研究中我们于角膜移植术后10 d取材，分析研究角膜移植免疫排斥反应的发生过程。

Figure 1 Flow cytometry analysis of rate of CD4+CD25+Foxp3+Treg in spleen cell at 10 days after operation.A:P1:Gated on spleen cell;B:P2:Gated on CD4+Treg;C:Q2:Rate of CD4+CD25+Foxp3+Treg 术后10 d，流式细胞学测定脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg所占比例。A:P1门表示选取脾脏中单个核细胞;B:P2门代表CD4+T细胞;C:流式细胞测定CD4+CD25+Foxp3+Treg比例，Q2部分为CD4+CD25+Foxp3+Treg

3.2 CD4+CD25+Foxp+Treg与前房相关免疫偏离Treg是不同于Th1和Th2的具有免疫调节功能的T细胞群体，具有免疫抑制功能，在多种免疫性疾病中起重要的调节作用。研究发现Treg与前房相关免疫偏离密切相关[14-16]。CD4+CD25+Treg细胞分化发育的具体机制尚不清楚，已被证实具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特性，可以通过直接细胞接触机制或分泌调节性细胞因子(IL-10和TGF-β)主动抑制免疫细胞的活化，在维持机体免疫耐受和免疫应答稳态方面具有重要作用。大量实验证明[17-20]，CD4+CD25+Treg的发育及免疫功能的维持与转录因子Foxp3有关。Foxp3可能通过以下4条途径参与Treg的功能维持:(1)Foxp3能直接抑制效应基因的表达(如IL-2基因的表达);(2)Foxp3能竞争结合与细胞活化相关基因，间接抑制效应基因的转录;(3)Foxp3作为一个转接蛋白招募其他具有抑制功能的效应分子与目的基因结合;(4)上调某些抑制性细胞因子的表达。有多项研究表明，器官移植术后，高表达Foxp3或CD4+CD25+Treg可诱导机体的免疫耐受[21]，Foxp3的表达水平与有功能的Treg水平密切相关[22]。Muthukumar等[23]研究发现在肾移植后出现排斥反应的患者，尿液中Foxp3相对于正常者明显高表达，Foxp3的表达被看成是急性排斥反应的标志，而且他们认为Foxp3表达越低，移植肾越难存活。Dijke等[24]认为，发生排斥反应时，移植物内Foxp3+Treg的高表达是抑制效应性T细胞应答的一种反应。本实验也发现治疗组大鼠脾脏中Foxp3表达增高，植片存活时间明显延长。

3.3 MSC对Treg的免疫调控作用 多项实验研究表明MSC能够抑制多种免疫细胞的增殖和功能，包括T细胞、B细胞、NK细胞以及树突状细胞，来发挥强大的免疫抑制作用[25-28]。最新研究表明，MSC还可能通过多种机制影响CD4+CD25+Treg的免疫生物活性[29-31]，比如招募 CD4+CD25+Treg，促进其分化，以及维持其免疫抑制活性。同种异源MSC直接与CD4+T细胞接触，随后分泌PGE2和TGF-β，可以促进CD4+CD25+Treg的分化和增殖。我们前期研究表明MSC可以通过抑制T细胞免疫应答和改变Th1/Th2应答平衡，显著抑制大鼠角膜移植排斥反应。在本研究中，我们采用流式细胞术和RT-PCR方法，检测了MSC处理组与对照组脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例及单个核细胞中Foxp3 mRNA的表达情况，结果显示，与对照组相比，MSC治疗组大鼠体内Treg比例以及Foxp3 mRNA的相对表达量均显著升高，表明MSC可能可以通过促进Treg的分化和增殖抑制角膜移植免疫排斥反应的发生。MSC上调CD4+CD25+Foxp3+Treg的作用机制尚需进一步研究。

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