冠心病血瘀证的血清差异蛋白质组学研究＊

周倩倩 李治国 黄 力

冠心病属于中医学“胸痹”、“心痛”范畴，血瘀证是冠心病中医证候辨证中较常见的症候类型。蛋白质组学技术在中医药领域中的应用，为中医证型实质的研究提供了新的方法。本研究采用蛋白质组学的相关技术方法，分析冠心病血瘀证患者和健康人群之间血清蛋白质的差异，以期发现与冠心病血瘀证相关的特异性蛋白质。

1 材料与方法

1.1 对象与分组

冠心病血瘀证患者（疾病组）均为2009年9月～2010年11月中日友好医院中西医结合心内科门诊及住院病人8例，男女各4例，平均年龄69.50±9.78岁；健康人群（对照组）8例，均来自北京中医药大学体检正常的健康志愿者，男3例，女5例。病例组西医诊断符合 WHO／ISEC制定的《缺血性心脏病的命名和诊断标准》［1］，中医诊断标准符合中国中西医结合学会心血管病专业委员会于1990年修订的《冠心病中医辨证标准》［2］，并参考中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会于1986年制定的血瘀证诊断标准［3］。对照组无糖尿病、高血压、高脂血症、肾脏疾病及外周血管病变；排除已发生心肌缺血而目前处于稳定期的患者，包括经冠状动脉造影证实的冠状动脉粥样硬化性心脏病或陈旧心肌梗塞，或以前曾行经皮冠状动脉介入治疗（PCI）或冠状动脉搭桥术后患者。

1.2 主要实验试剂和仪器

固相 pH 梯度干胶条（pH3－10NL，24cm）、IPG buffer（pH3－10）、二硫苏糖醇（DTT）、SDS、Tris均购自美国Amersham Bioscience公司；碘乙酰胺、考马斯里亮蓝G－250购自美国Amresco公司；四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（AP）购自美国Sigma公司。

IPG phorTM等电聚焦仪（美国Amersham Pharmacia Biotech公司），Ettan DaltTwelve垂直电泳系统（美国Parafilm公司），ImageScannerⅢ透射扫描仪、Labscan扫描控制和分析前处理软件（美国GE Healthcare公司），PD－Quest图像分析软件（美国Bio－Rad公司），MALDI－TOF－MS质谱仪（美国UltraFlexⅢTOF＆TOF／TOF，Bruker Daltonics公司）。

1.3 血清标本的采集和电泳

清晨采集两组人群外周静脉血3ml于非抗凝真空采血管中，3 000rpm离心10min，分离血清，于－80℃冰箱内贮存备用。采用Bradford法测定各血清样本的蛋白浓度后进行双向凝胶电泳。第一向固相PH梯度等点聚焦（IEF）：于含1mg蛋白的血清样本中加入1%IPGbuffer，水合液稀释至450μl，混匀上样，水化合等点聚焦在20℃进行，总电压为90 000Vh。 具 体 参 数 如 下：30V12h，250V1h，500V1h，1 000V1h，8 000V30min，8 000V 至90 000 Vh。第二向垂直SDS－PAGE电泳：平衡后的IPG胶条移至12%SDS－PAGE胶上端，加入SDS电泳缓冲液，电泳条件为25℃，2W／gel电泳30min，然后按每块胶17W的恒功率电泳，直到溴酚蓝指示线到达凝胶底边为止。2－DE凝胶固定后以考马斯亮蓝G－250染色。

1.4 图像分析和质谱鉴定

凝胶脱色后经LabScan和ImageScanner透射扫描，运用PD－Quest软件对各组凝胶图谱进行蛋白点检测、标准化、匹配、统计学处理，找寻差异表达的蛋白质点。采用 MALDI－TOF－MS进行质谱分析，获得肽质量指纹谱（由军事医学科学院生物医学中心完成），运用 Mascot软件搜索Swissprot和NCBInr数据库，得到差异蛋白质的相关信息。

2 结 果

2.1 两组2－DE结果

对两组中单个血清样本分别进行双向凝胶电泳分离，分两次进行，第一次3例／组，第二次5例／组，两组各获得8个凝胶图谱，所得典型的双向凝胶电泳图如图1所示。图谱信息经PD－Quest软件分析显示，对照组及病例组的平均蛋白质点数分别为153.60±27.57和146.60±19.99，通过背景消减、匹配分析，共得到12个差异蛋白质点，其中，部分差异蛋白质点的局部放大图见图2。

图1 典型双向凝胶电泳图示例

图2 差异点局部放大图示例

2.2 质谱鉴定结果

对12个蛋白质点进行质谱分析，得到各个点的肽质量指纹谱，如图3所示。运用Mascot软件搜索Swissprot和NCBInr数据库，共有11个点得到阳性鉴定，通过整合重复蛋白点后，确认为6个差异蛋白质点，其中，病例组与对照组相比，表达上调的点有3个：视黄醇结合蛋白4（Retinol－Binding Protein 4）、结合珠蛋白（Haptoglobin）、血清白蛋白（Serum Albumin），表达下调的点有1个：载脂蛋白 A1（Apolipoprotein A－I），在两次实验中表达不一致的点有2个，为避免实验的假阳性，这2个点暂不予以考虑，如表1所示。

表1 6个差异蛋白质点

图3 蛋白质点的MALDI－TOF－MS质谱结果示例

3 讨 论

视黄醇结合蛋白4与心血管疾病的关系在国外研究中已有报道［4，5］，认为其血清水平的升高可能与动脉粥样硬化的发生发展密切相关［6，7］，有研究发现冠心病患者的血清水平明显高于健康者［8］；国内也有研究得出类似结果［9］。

结合珠蛋白是一种急性相蛋白［10］，在多种应激反应过程中，其血清表达明显升高；在抗氧化反应、减少细胞损伤、炎症反应中，结合珠蛋白也发挥重要作用［11］。

血清白蛋白是人体血清中含量最丰富的蛋白质，研究认为其浓度水平对冠心病的早期发现及预后具有一定的预测价值［12］。国外一项荟萃分析表明，低血清白蛋白组发生冠心病及冠心病的死亡风险均明显高于高血清白蛋白组［13］，同时国内研究［14］发现，与对照组相比，血清白蛋白水平在急性心肌梗死患者组明显降低，且与其临床预后有很好的相关性。

载脂蛋白A1是高密度脂蛋白（HDL）的主要蛋白成分，能够促进胆固醇的清除，并且在抗炎症反应、抗氧化反应过程中发挥重要作用［15］，目前研究［16］表明，ApoA1能防止动脉粥样硬化发生，对评价心血管疾病的危险程度、心肌梗死及其它心血管事件具有很好的预测价值。

既往对冠心病血瘀证的客观化研究［17］发现，冠心病血瘀证与血液流变学、微循环障碍、血脂代谢障碍、血小板功能及抗凝－纤溶系统异常、血管内皮细胞损伤及免疫功能异常等过程相关。国内有研究在利用双向电泳技术寻找与心绞痛血瘀证相关的蛋白时，发现了包括载脂蛋白A1、结合珠蛋白、血清白蛋白等在内的与血瘀证相关的差异蛋白质［18］，认为不稳定心绞痛血瘀证可能是一种炎症反应，同时与脂代谢紊乱、凝血因子异常、心肌损伤等有关［19］。而在另一冠心病血瘀证的血浆蛋白质组学研究中［20］，发现了纤维蛋白原、免疫球蛋白、粒酶等与凝血、内皮损伤、免疫炎症反应等相关的蛋白质，可以发展成为冠心病血瘀证的诊断标记物。

本文的研究结果表明，冠心病血瘀证相关的蛋白质主要集中于炎症反应和脂质代谢方面，与文献报道基本一致，同时也发现了像视黄醇结合蛋白4等具有深入研究意义的蛋白质，为进一步寻找冠心病血瘀证相关蛋白提供了线索。由于双向凝胶电泳技术存在自身不足和局限性，本研究只得到了与冠心病血瘀证相关的部分蛋白质的信息，随着技术的不断创新和发展，实验结果及其意义会得到进一步验证和完善，其机制有待进一步探索。

1 陈灏珠.实用内科学［M］.第12版.北京：人民卫生出版社.2005：1 472～1 473.

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