果糖基肽氧化酶法测定糖尿病患者HbA1c

刘 俊 付 波

糖化血红蛋白（HbA1c）含量可反映糖尿病（DM）患者过去2～3个月时间内平均血糖水平，如果能将其降至8.1%以下，DM并发症的发生将会大大减少。因此，一种快速、简便，准确性及精密度均符合临床要求的HbA1c检测方法对DM治疗、预后均有重要意义。本文采用一种新的酶学方法——果糖基肽氧化酶法测定58例DM患者HbA1c浓度，并与阳离子交换高效液相层析法进行线性回归对比分析，以及观察其精密度和各种干扰因素的影响。

1 资料与方法

1.1 检测对象

选取58例DM患者，其中男39例，女19例；年龄17～59岁，平均46.55岁；T1DM 15例，T2DM 43例，均符合1999年WHO和美国DM协会诊断标准［1］。

1.2 仪器与试剂

美国雅培AEROSET全自动生化分析仪，所用果糖基肽氧化酶法试剂、前处理液、校准品及质控品由日本第一化学公司提供；阳离子交换高效液相层析全自动HbA1c分析仪（HLC－723G7）及配套试剂由日本TOSOH公司提供。

1.3 检测方法

采集58例DM 患者空腹静脉血2ml，EDTAK2抗凝，同时用两种方法检测HbA1c含量。果糖基肽氧化酶法：标本经800g离心力离心5min，取红细胞层25μl加入500μl前处理液中，放置5min后上机测定。其原理为：第一反应中，在蛋白酶的作用下切断源于血红蛋白A1c的β链N末端的糖化二肽，同时通过测定600nm与800nm的吸光度差，求出Hb的浓度；第二反应中，果糖基肽氧化酶作用于糖化二肽，在过氧化物酶存在下生成的过氧化氢与N－（羧甲基氨基羰基）－4，4’二甲胺基二苯胺化钠（显色剂）产生显色反应。通过测定此吸光度求出HbA1c的浓度，根据求得的HbA1c浓度与Hb浓度计算出HbA1c（%）。阳离子交换高效液相层析法：直接检测血液总Hb中的A1c（%）。

1.4 分析指标

（1）对两种方法的测定结果进行线性回归分析，以评价两种检测结果的相关性。（2）取HbA1c低、高值质控品各1份，采用果糖基肽氧化酶法同批检测20次，评估批内精密度。（3）低、高值两种质控物分别连续测定20天，计算批间精密度。（4）分别在样本中加入不同浓度脂肪乳、葡萄糖和胆红素，评价其对果糖基肽氧化酶法测定HbA1c结果的干扰情况。

2 结 果

2.1 两种检测方法的线性回归分析

对两种检测方法的测值进行线性回归，结果显示两者呈显著正相关（r＝0.9637），线性方程Y＝0.9711X＋0.1607（Y为果糖基肽氧化酶法测定值，X为阳离子交换高效液相层析法测定值）。

2.2 果糖基肽氧化酶法的精密度

果糖基肽氧化酶法测定HbA1c低、高值质控品的批内变异系数分别是3.10%、3.50%，平均变异系数为3.30%；批间变异系数分别为4.20%、4.30%，平均批间变异系数4.25%。见表1。

表1 果糖基肽氧化酶法的精密度（%）

2.3 干扰试验

将不同浓度胆红素（100～500μmol／L）、脂肪乳（0.5～2.0%）、葡萄糖（2.0～10.0g／L）分别加入待测样本中，采用果糖基肽氧化酶法测定加入干扰物前后的测定值偏差，结果显示各种浓度胆红素、脂肪乳、葡萄糖对测定结果无明显干扰，偏差均＜0.30%。

3 讨 论

HbA1c作为DM筛选、诊断、血糖控制、疗效观察的有效检测指标在临床中已广泛应用。目前主要检测方法有五种：阳离子交换高效液相层析法、微柱法、电泳法、亲和层析法、免疫法，其中离子交换高效液相层析法是金标准方法，而免疫法是目前生化分析仪上常用的检测方法。因为各种方法的原理不同，测定结果的准确度、重复性可能有所差异。本文采取DM患者血标本，应用果糖基肽氧化酶法和离子交换高效液相层析法测定，结果表明两法相关性良好，r＝0.9637，批内和批间CV分别为3.30%、4.25%，符合试剂盒批内CV≤5%、批间CV≤10%的要求。同时也观察了主要干扰因素胆红素、脂肪乳、葡萄糖对检测结果的影响，结果显示三者加入标本中引起的偏差均小于0.30%，可以忽略不计。

值得注意的是，在采用果糖基肽氧化酶法测定DM患者HbA1c浓度时，（1）高速离心后，需正确采集血液细胞层，因为不同层面的血细胞HbA1c结果会有较大差别［2］，建议使用800g离心力离心5min，在血细胞层高度的20～80%范围内采集标本；（2）同时应该避免标本溶血或保存时间过长；（3）所测标本的 Hb浓度高于160g／L或低于50g／L时，应调整前处理液的用量，以得到更准确的结果；（4）使用糖与氨基酸混合输液患者，其标本测定结果可能出现假性增高。

1 叶任高，陆再英主编.内科学［M］.第6版.北京：人民卫生出版社，2004.787～795.

2 宫下瞮夫.日本临床检查自动化学会会志，2004，29：181.