细胞色素2J3基因转染对大鼠胸主动脉球囊损伤后血管狭窄程度的影响及其机制探讨＊

宗 哲 付 研 李大鹏 程 晋 王 磊 李建中 常 静 张立克

血管介入是治疗外周血管阻塞性疾病和心脑血管疾病的常用方法，但术后血管再狭窄（Restenosis，RS）是临床应用中的主要问题。由于术后RS的形成是多因素、多环节参与的复杂过程，因此调动机体内源性抗RS的多种机制，对预防RS，尤其是术后远期RS非常重要。

近年来，细胞色素P450／环－二十碳三烯酸（Cytochrome P450／Epoxyeicosatrienoic Acids，CYP450／EETs）对血管的多环节作用引起人们的重视。人血管内皮细胞及平滑肌细胞中存在着CYP450的亚型2J2（CYP2J2），而大鼠血管内皮细胞及平滑肌细胞中存在的主要是2J3（CYP2J3），它们可催化花生四烯酸（Arachiodonic Acid，AA）生成11，12－环－二十碳三烯酸（11，12－Epoxyeicosatrienoic Acids，11，12－EET）等。

本文通过观察CYP2J3基因转染对实验大鼠胸主动脉球囊损伤后RS的影响，分析CYP2J3／EET系统与血管损伤后RS的关系，为阐明血管损伤后RS的发生机制，以及基因疗法在介入治疗术后RS的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级雄性 Wistar大鼠36只，体重280～300g，由军事医学科学院动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK－（军），NO：0059020；Western blotting发光试剂盒、BCA（Bicinchoninic Acid）蛋白定量试剂盒（美国Pierce公司）；总RNA提取及反转录试剂盒（美国Promega公司）；Taq Platinum PCR MasterMix及无内毒素质粒大量提取试剂盒（天根公司，中德合资）；DNA Marker及蛋白预染Marker（中国全式金公司）；无水乙腈（Anhydrous Acetonitrile）；96%甲酸（Formic Acid，美国 Sigma公司）；N，N－diisopropylethylamine（美国 Sigma公司）；固相萃取柱（Solid Phase Eextraction，SPE）（美国 Waters公司）；pcDNA3.1－CYP2J3质粒由首都医科大学病理生理教研室实验室构建；余各试剂均为市售分析纯产品；PCR引物由上海生工合成，内参β－actin上下游引物分别为：5’－ACC TAT CCC TTC AGC AGT TTG TG－3’，5’－TGG TAG GCT TCC TCT TGT ATT CG－3’，扩增产物大小为450bp；CYP2J3上下游引物分别为5’－ACC TAT CCC TTC AGC ATT TGT G－3’，5’－TGG TAG GCT TCC TCT TGT ATT CG－3’，扩增产物大小为300bp。

1.2 重组pcDNA3.1－CYP2J3质粒的提取和纯化

将前期构建成功的真核表达质粒PcDNA3.1－CYP2J3，分别经KpnI、NotI双酶切鉴定后，用无内毒素质粒大量提取试剂提取。紫外分光光度计（Eppendorf）检测提取质粒纯度 A260／A280≈1.8，浓度约1g／L。

1.3 实验分组及处理

大鼠饲养1周后，首先建立胸主动脉球囊损伤模型［2］（18只），于制模同时随机分为三组（每组6只），分别从鼠尾静脉注入生理盐水（动脉损伤盐水组）、CYP2J3重组质粒组（动脉损伤2J3组）及pcDNA3.1（动脉损伤3.1组），3ml／kg体重；另选18只实验大鼠亦随机分为三个假手术组，除不进行胸主动脉球囊损伤外，其它处理同上三组，分别为假手术盐水组、假手术2J3组和假手术3.1组，每组6只。术后第28天采用颈椎脱臼法处死各组大鼠，快速摘取胸主动脉，经生理盐水冲洗，剥离干净血管周围结缔组织后分别用0.01%DEPC水冲洗3遍后，取0.5cm～1.0cm段置于10%中性福尔马林中固定至少24h备用；取1.5cm～2.0cm段置于液氮或者深低温冰箱备用。

1.4 胸主动脉相对管腔面积（Rrelative Luminal Area，RLA）测定

取中性福尔马林固定24h的胸主动脉标本，经脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色后镜下观察。按照组织学划分血管内膜（内弹力膜以内）、血管中膜（内、外弹力膜之间）和血管外膜（外弹力膜以外）。在4倍物镜下将完整的血管横切面HE染色图像摄入计算机图像分析系统中进行图像编辑，用鼠标准确勾画出外弹力膜、内弹力膜以及管腔的轮廓，计算管腔面积（Lumenaera，LA），每张切片测3次，取平均值。以LA与内膜、中膜和LA之和的比值为RLA。

1.5 胸主动脉CYP2J3mRNA表达水平测定

自液氮中取出胸主动脉标本加入冷裂解液中，快速匀浆，经氯仿和异丙醇抽提、75%乙醇漂洗，室温干燥后得到RNA，加入DEPC水溶解。提取RNA作为PCR模板，采用RT－PCR法检测细胞CYP2J3mRNA表达，以其吸光度值与β－actin吸光度值的比值表示。

1.6 胸主动脉11，12－EET 含量检测

自液氮中取出胸主动脉标本，11，12－EET检测标本制备：20mg组织置于200μl甲醇和0.4μl甲酸中低温超声匀浆，提取上清液进行衍生，产物经氩气吹干后溶解于30μl无水乙腈中，置于－80℃深低温冰箱中保存。采用高效液相色谱法（High Pressure Liquid Chromatography，HPLC，安捷伦公司提供高效液相色谱分析系统）检测其11，12－EET 含量［8］。标准品为11，12－EET，层析柱为 Agilent公司SBC18，流动相：A相为0.5%甲酸水溶液，B相为0.5%甲酸乙腈溶液，流速1ml／min，层析条件：前40min B相浓度由50%增至65%，其后80min B相浓度由65%增至100%，最后以B相100%维持20min。11，12－EET色谱峰值出现在第85min左右。

1.7 统计学处理

采用SPSS13.0数据处理系统进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（s）表示。各组间计量资料的比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA），差异显著，则采用最小显著差（Least Significant Difference，LSD）法进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组RLA

假手术组2J3基因转染及单纯PC3.1质粒对动脉环RLA无明显影响（P＞0.05），而胸主动脉损伤使RLA减小（P＜0.05或P＜0.01）；但动脉损伤2J3组RLA明显大于动脉损伤盐水组及动脉损伤3.1组（P＜0.01），提示CYP2J3基因转染可减轻动脉损伤后血管狭窄的程度（图1）。

图1 各组大鼠胸主动脉相对管腔面积比较（s，n均＝6）

2.2 各组CYP2J3mRNA表达

假手术2J3组CYP2J3mRNA表达高于假手术盐水组及假手术3.1组（P＜0.05），表明转染成功；胸主动脉损伤各组CYP2J3mRNA均表达上调，尤以动脉损伤2J3组CYP2J3mRNA表达更高于动脉损伤盐水组及3.1组（P＜0.01），提示CYP2J3基因转染后动脉损伤使CYP2J3mRNA表达进一步提高（图2）。

图2 各组大鼠胸主动脉CYP2J3mRNA表达水平比较（s，n均＝6）

2.3 各组11，12－EET 含量

三个假手术组之间11，12－EET水平差异无统计学意义，说明基因转染对正常胸主动脉11，12－EET水平无显著影响；胸主损伤各组11，12－EET水平明显升高（P＜0.01），而动脉损伤2J3组高于动脉损伤盐水组及3.1组（P＜0.01），说明CYP2J3基因转染可使损伤动脉11，12－EET水平进一步提高（图3）。

图3 各组大鼠胸主动脉11，12－EET水平（s，n均＝6）

3 讨 论

CYP450单氧化酶可催化AA生成四种EETs：5，6－；8，9－；11，12－；14，15－EETs［1］。作为内皮衍生性超极化因子（Endothelium Derived Hyperpolarizing Factor，EDHF）的 EETs具有舒张血管［4］、抗血栓形成［5］、促进血管内皮细胞增殖［6］等多种血管保护作用。近年研究发现，EETs还与血管发生有关［7］。研究者还发现，11，12－EET 作为内源性物质具有拮抗缺血／再灌注损伤的心脏保护作用及拮抗内皮细胞缺氧／复氧损伤作用［8］；常氧下 11，12－EET拮抗血管平滑肌细胞增生及迁移，缺氧下抑制血管平滑肌细胞增殖和促进其凋亡等多种血管保护作用［9］。

经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）是目前治疗冠心病的最为有效的方法之一，但术后6个月内30～45%的RS严重影响了PTCA的临床疗效［10］。虽然随后支架置入术应用其中，但支架置入术后RS发生率仍为32～35%［11］，使PTCA的远期疗效受到了很大限制，因此RS的防治成为目前心血管病防治研究的重要课题。有研究认为，RS是动脉损伤的愈合过程，有血管弹性回缩、血小板沉积，血栓形成、炎症反应、基质沉积、血管重塑、血管平滑肌细胞（VSMC）迁移、表型转化、过度增殖和凋亡减少等多种因素参与，其中内皮细胞损伤是RS的始动因素。目前，为防治PTCA术后RS发生的措施主要包括药物治疗、介入治疗、安放药物洗脱支架和基因治疗。其中基因治疗是当前研究的热点，也是防治PTCA术后RS的一种新方法。

本实验通过静脉直接注射裸质粒的方法导入CYP2J3重组质粒，发现假手术2J3组CYP2J3mRNA表达高于假手术盐水组及3.1组，表明转染成功；但假手术2J3组、假手术盐水组及3.1组11，12－EET水平差别无显著性，提示CYP2J3基因转染未损伤动脉。本研究还发现，损伤胸主动脉可提高其CYP2J3mRNA表达，同时提高11，12－EET水平，而动脉损伤2J3组不仅CYP2J3mRNA表达高于假手术2J3组及动脉损伤盐水组，其11，12－EET水平也是如此。提示胸主动脉损伤可能使转染的CYP2J3基因发挥作用而生成11，12－EET。

对未损伤动脉大鼠进行CYP2J3基因转染及注射pcDNA3.1质粒未引起动脉的RLA明显变化，但胸主动脉损伤则使RLA减小。CYP2J3基因转染胸主动脉损伤大鼠的RLA明显大于动脉损伤盐水组及3.1组，表明CYP2J3／EETs系统上调缓解了动脉损伤后狭窄，提示CYP2J3／EETs系统上调可能是动脉损伤后防止血管狭窄的重要机制。

动脉损伤后，再狭窄的形成是一个多因素、多环节共同作用的复杂问题，无论是发病机制和防治措施仍然存在许多疑点和难点，有待于更深层次的研究。

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