侵染椒样薄荷的病毒种类的分子鉴定

郝小军，王胜，黄家风

（石河子大学绿洲农作物病害防控重点实验室，石河子832003）

椒样薄荷（Mentha piperita L.）又名胡椒薄荷，欧洲薄荷、辣薄荷，为唇形科薄荷属多年生宿根草本植物。其精油在化妆品、香水、牙膏以及口香糖、饮料、糖果、糕点制作中广泛应用［1］。新疆是我国最大的椒样薄荷种植区，年产椒样薄荷精油18万kg，占全国总产量的80%以上。近年由于椒样薄荷品种退化加重，造成新疆精油产量和品质逐年降低［2－3］。大量资料显示，病毒侵染是许多无性繁殖作物品种退化、品质变差的主要因素之一。尽管薄荷属植物约有30种，但侵染薄荷属的病毒种类却很少，目前已报道的有薄荷病毒X（MVX）、薄荷病毒A（MVA）、薄荷潜隐病毒（MLV）、草莓潜隐环斑病毒（SLRV）和巴基斯坦番茄曲叶病毒（To LCBV）等［4－5］。而有关椒样薄荷的品种退化是否是病毒侵染所致，及可能的病毒种类尚未见相关报道。因此，进行椒样薄荷病毒种类鉴定时，由于缺乏相关的病毒信息，常规RT－PCR方法的应用受到限制。

双链RNA（dsRNA）分离技术的主要依据是大多数病毒或类病毒在复制时会产生较大分子量的dsRNA，而正常的植物组织则不产生，因此可将其作为植物病毒及类病毒检测和诊断的依据。以dsRNA为模板通过单引物扩增（single primer amplification technique，SPAT）获得病毒基因组是鉴定病毒的一种主要方法。SPAT是在dsRNA 3′末端加上一段3′末端被氨基修饰了的DNA寡核苷酸序列作为接头（primer A），然后用与此接头互补的DNA寡核苷酸序列作为引物（primer B）进行RTPCR，即可获得大量cDNA产物。SPAT方法不受任何序列限制，适用于任何已知或未知序列的dsRNA 克隆［6］。

本研究通过对椒样薄荷病株进行dsRNA分离、单引物扩增，从病株中克隆到CMV的1a基因片段；根据所获病毒信息，设计了3对针对CMV的特异引物，从病株中均能扩增到相应的目标片段，从而明确CMV可以侵染椒样薄荷。研究结果为探索椒样薄荷品种退化、病害防治奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

叶片变红并伴有花叶症状的2株椒样薄荷MP1和MP2采自伊犁新疆兵团农四师65团。纤维素CF－11购自Promega公司；T4RNA Ligase、LA Taq TM、T4DNA Ligase、p MD18－T Vector购自Ta KaRa公司；DTT、RNasin购自Invitrogen公司；2×Taq DNA聚合酶 Mix为东盛生物公司产品；胶回收试剂盒为鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品；其余试剂为进口或国产分析纯。PCR引物由北京华大基因科技发展有限公司合成，RT－PCR所需引物如表1。

表1 PCR扩增所用引物序列Tab.1 Sequences of primer pairs for PCR amplification

1.2 以dsRNA为模板的单引物扩增、克隆与测序

取5 g新鲜感病椒样薄荷叶片提取dsRNA，参考Chen等［6］的方法。以提取的dsRNA为材料，在T4RNA连接酶的作用下，将寡核苷酸接头primer A与dsRNA模板的3′－OH连接。连接反应如下：2 μL 10×T4RNA Ligase Buffer、10μL PEG（50%）、1μL BSA（0.1%）、0.5μL T4RNA Ligase、1μL T4DNA Ligase、4 μL dsRNA、1μL Primer A，用dd H2O补足20μL。16℃连接16 h。然后将连接产物进行末端补平，反应条件为：25μL连接产物、0.5μL d NTP、0.5μL Taq DNA polymerse、3μL 10×PCR Buffer，68℃水浴3 h，用无水乙醇抽提连接产物，溶于10μL的dd H2O。最后利用单一引物primer B进行RT－PCR。PCR扩增反应参数设置如下：94℃5 min，94 ℃30 s，60℃45 s，72℃1 min，30个循环，72℃10 min。回收PCR产物并克隆到载体p MD18－T上，选择PCR和酶切鉴定均为阳性的克隆进行测序。测序工作由北京华大基因科技发展有限公司完成。

1.3 以植物总RNA为模板的RT－PCR、克隆与测序

取新鲜感病椒样薄荷叶片提取总RNA，采用改良的LiCl沉淀法进行［7］。然后以CMV的3对特异引物进行RT－PCR、克隆和测序。PCR扩增反应参数设置如下：94℃5 min，94℃30 s，退火温度根据扩增引物Tm值设定，时间30 s，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。

1.4 序列分析

测序结果提交NCBI进行BLAST检索比对。用软件 DNAStar 5.02和 DNAMAN version 5.2.2进行序列分析。多序列比较采用DNAStar clustal W方法，进化树构建采用DNAMAN的邻近相连法（Neighbor－joining）。

2 结果与分析

2.1 病毒dsRNA的分离

利用dsRNA分析法对病样MP1和MP2进行初步检测，琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示，2个样品均可电泳出3条带，且带型相同，约为3.4、2.2和1.8 kb。由此说明，2个病株都受到了相同病毒的侵染。

图1 椒样薄荷病株dsRNA电泳分析Fig.1 Electrophoresis analysis of dsRNAs from M.piperita L.

2.2 以dsRNA为模板的单引物RT－PCR、克隆与序列分析

回收以上3.4、2.2和1.8 kb的电泳条带，分别记作R1、R2和R3，然后分别作为模板，通过单引物法获得cDNA并进行PCR扩增。以R1为模板扩增到2个条带，约为350和1000 bp；以R2为模板扩增到1条350 bp左右的片段；而以R3为模板未扩增任何条带（图2）

将R1为模板扩增到的2个片段分别连接到p MD18－T上进行克隆和测序，得到2个目标片段的核苷酸序列分别为976和352 bp。将它们在Gen－Bank中进行BLAST，976 bp片段序列在GenBank中没有相似的基因序列。352 bp片段的序列与CMV基因组RNA1组分具有很高的序列相似性，其中与CMV－LW 分离物RNA1组分（登录号：EU414792）上的1a基因499～850位核苷酸的序列同源性高达97.2%，结果表明，新疆椒样薄荷受到CMV的侵染。

图2 单引物扩增的RT－PCR结果Fig.2 RT－PCR results by single primer amplification technique

2.3 目标基因的RT－PCR、克隆与序列分析

为了进一步明确CMV侵染椒样薄荷，由以上鉴定结果获得的信息，根据GenBank中登录的CMV基因组序列设计了3对针对CMV 2a基因、2b基因和CP基因的特异引物，对病毒分离物MP1和MP2进行了相应目标基因的RT－PCR。结果均扩增到预期的目标片段，如图4所示，用针对CMV 2a基因的引物2a－F和2a－R扩增到约500 bp的目标片段（图3a）；用针对CMV 2b基因的引物2b－F和2b－R扩增到约350 bp的目标片段（图3b）；用针对CMV CP基因的引物Cp－F和Cp－R扩增到约770 bp的目标片段（图3c）。

图3 病毒分离物MP1和MP2目标基因的RT－PCR扩增Fig.3 RT－PCR amplified of isolates MP1 and MP2

对MP1分离物的770 bp片段进行克隆和测序，得到该片段序列为774个核苷酸 。基因库检索表明，该序列为CMV RNA3组分上的部分序列，含有1个由657个核苷酸的开放阅读框（CP基因），编码由219个氨基酸组成的CP蛋白。该片段核苷酸序列及其编码的蛋白氨基酸序列与国内外报道的其它CMV分离物有很高的序列相似性，核苷酸同源性高达93.4%～96.9%，氨基酸同源性高达95.4%～99.1%（表2）。基于CP基因构建系统关系树，MP1分离物与来自福建的PE分离物形成1个小的进化分支，进而与来自希腊、台湾、意大利、西班牙、印度、中国江苏和云南的分离物形成1个大的进化分支，其它来自澳大利亚、广东、台湾和浙江的分离物形成1个进化分支，湖北的2个分离物和意大利的1个分离物分别单独形成1个进化分支（图4）。因此，CMV CP基因从进化过程中不以地理分布为基础，这与该病毒寄主范围广泛、世界分布相适应性。

表2 CMV分离物MP1与其它分离物CP基因核苷酸和氨基酸同源性比较Tab.2 Comparison of nucleotide and amino acid sequence identities of CP gene and encoded proteins among MP1 and other isolates of CMV

图4 基于CMV CP基因核苷酸序列构建的系统关系树Fig.4 Phylogenetic tree based on alignments of nucleotide sequences of CMV CP

3 结论与讨论

通过对病组织进行dsRNA分离、单引物扩增、克隆和测序，从椒样薄荷病样中获得CMV 1a基因的部分序列。CMV是一种三分体病毒，基因组由3个单链RNA（RNA1、RNA2和RNA3）分子组成。RNA1编码1a基因；RNA2编码2a和2b基因；RNA3编码3a基因和CP基因。为了进一步明确CMV侵染椒样薄荷，针对CMV 2a基因、2b基因和CP基因设计特异引物，对病毒分离物MP1和MP2进行了相应目标基因的RT－PCR，结果均扩增到预期的目标片段。由此说明，CMV的3个RNA组分都存在于椒样薄荷病株中，椒样薄荷受到CMV侵染。

本研究在分离dsRNA时获得了3条大小不同的条带，但利用SPAT方法只克隆到CMV RNA1部分基因片段和1段976 bp的未知序列，未知序列是一种新病毒还是寄主椒样薄荷的某段序列还需要进一步明确。虽然用该方法经过多次重复实验，也未能扩增到3个条带的全序列，可能是各基因组片段在寄主中的含量较低，或是分离dsRNA时椒样薄荷的物质去除不尽，抑制了以dsRNA为模板进行单引物扩增的某个过程。此外，dsRNA结构相对稳定、平末端接头连接效率低、较大片段扩增受限制等问题，也是影响该方法在克隆植物dsRNA病毒基因组的关键因素［8－9］。因此，利用该方法如何提高扩增效率还需要进行深入研究。

［1］窦宏涛，陈琳.陕西省不同海拔高度地区椒样薄荷精油成分分析及香气品质评［J］.中国农学通报，2009，25（23）：132－136.

［2］Wang X H，Gao Z H，Wang Y Z.Highly efficient in vitro adventitious shoot regeneration of peppermint（Mentha x piperita L.）using internodal explants［J］.In Vitro Cell，2009，45：435－440.

［3］王佳武，王朴，唐永清.新疆伊犁薄荷病虫害综合防治［J］.北方园艺，2011（11）：122－123.

［4］Tzanetakis I E，Postman J D，Martin R R.Identification，detection and transmission of a new virus from Mentha［J］.Archives of Virology，2007，152：2027－2033.

［5］Samad A，Gupta M K，Shasany A K，et al.Begomovirus related to Tomato leaf curl Pakistan virus newly reported in Mentha crops in India［J］.Plant Pathology，2009，74：166－172

［6］Chen L，Chen J S，Liu L，et al.Complete nucleotide sequences and genome characterization of double－stranded RNA1 and RNA 2 in the Raphanus sativus－root cv.Yipinghong［J］.Arch Virol，2006，151：849－859.

［7］常波，向本春，刘升学，等.加工番茄条斑坏死病原黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析［J］.石河子大学学报：自然科学版，2006，24（4）：410－414.

［8］Potgieter A C，Steele A D，Vandijk A A.Cloning of complete genome sets of six dsRNA viruses using an improved cloning method for large dsRNA genes［J］.Journal of General Virology，2002，83：2215－2223.

［9］赵洪斌，唐香山，陈集双.杭州地区玉米病毒病dsRNA序列分析［J］.科技通报，2011，27（1）：45－49.