P63蛋白在新疆哈萨克族食管癌中的表达及意义

常爱敏，马彦清，马进，刘春霞，陈云昭，蒋金芳，李锋

（1石河子大学医学院病理系／新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002；2伊犁州友谊医院胸心外科，伊犁835000）

食管癌（Esophageal Carcinoma，EC）是人类常见的消化道恶性肿瘤之一，以鳞癌最为常见［1］，新疆北部以游牧为生的哈萨克族聚集区是我国食管癌集中高发区之一［2］。

P63基因是抑癌基因P53家族成员之一，两者在结构和功能上均有高度同源性。P63基因某些蛋白异构体能够反式激活P53靶基因的转录并诱导细胞凋亡，被认为是肿瘤抑制基因，另一些异构体则被认为是致癌基因［3］。P63蛋白是肿瘤和细胞凋亡研究领域中的热点之一。

目前，P63在该地区食管癌癌变过程中的变化特征和作用机制尚不清楚，因此，本研究在课题组前期工作的基础上，应用组织芯片和免疫组化技术研究P63蛋白在哈族食管鳞癌及癌旁非癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系，为进一步阐明P63基因在食管癌发生发展中的作用提供证据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1材料收集1996～2011年石河子大学医学院第一附属医院、新疆伊犁州友谊医院、新疆伊犁州新华医院、新疆生产建设兵团农四师医院和新疆奎屯伊犁州人民医院病理科哈萨克族食管鳞癌石蜡包埋组织标本85例。其中男性56例，女性29例，患病平均年龄59.4岁（34～78岁）。按食管癌国际TNM标准分期（2010年）。所有患者术前均未接受放化疗及其他抗肿瘤治疗。37例正常食管组织均来自上述肿瘤患者的癌旁非癌组织。

1.1.2主要试剂鼠抗人P63单克隆抗体（工作液1∶200）、Envision二步法试剂盒（北京中杉金桥公司）；枸橼酸缓冲液、DAB显色试剂盒 （Dako公司）。

1.2 方法

组织芯片的免疫组化染色采用Envision法，具体操作参照抗体说明书进行，主要步骤如下：组织标本经过常规石蜡包埋，脱蜡水化后，于枸橼酸缓冲液（0.01 mol／L，p H 6.0）中微波加热进行抗原修复10 min。其余步骤严格按试剂盒说明书操作（抗体稀释浓度为1∶200）。PBS代替一抗作阴性对照，由试剂公司提供的照片作阳性对照。

1.3 结果判定

采用免疫组化Envision法检测P63蛋白表达情况，严格按照免疫组化步骤进行操作，P63染色结果主要定位于细胞核，结果判定由两位病理学专家阅片，计算阳性细胞百分比，两位阅片专家意见不一致时请第三方阅片，最终决定免疫组化结果。

表1 免疫组化结果判定标准Tab.1 The results of immunohistochemistry criteria

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，四格表χ2检验及行×列表χ2检验，P＜0.05（双侧）有统计学意义。

2 结果

2.1 P63蛋白在食管鳞癌和癌旁非癌组织芯片中表达

检测结果见图1～4。

图1 P63在食管鳞癌组织中细胞核表达 ＋（×100）Fig.1 Nuclear expression of P63＋in esophagea squamous cell carcinoma（×100）

图2 P63在食管鳞癌组织中细胞核表达 ＋＋（×100）Fig.2 Nuclear expression of P63＋ ＋in esophagea squamous cell carcinoma（×100）

图3 P63在食管鳞癌组织中细胞核表达 ＋＋＋（×100）Fig.3 Nuclear expression of P63＋＋＋in esophagea squamous cell carcinoma（×100）

图4 P63在癌旁非癌组织中细胞核表达 ＋（×100）Fig.4 Nuclear expression of P63＋in non－cancerous adjacent tissue（×100）

由85例新疆哈萨克族食管鳞癌构成的组织芯片中，P63蛋白在71例（83.5%）食管鳞癌中表达阳性，其中54例（63.5%）强阳性表达（＋＋／＋＋＋）（图1，图2，图3）。37癌旁非癌组织中，22例表达阳性（图4），表达阳性率为59.4%。经统计学卡方检验分析，结果表明P63在食管鳞癌及癌旁非癌组织中蛋白表达差异有显著性（χ2＝8.242，P＜0.005），且P63在哈族食管鳞癌组织中表达高于癌旁非癌组织中的表达（表2）。

表2 P63蛋白在新疆哈萨克族食管鳞癌及癌旁非癌组织中的表达情况Tab.2 The expression of p63 protein in esophageal squamous cell carcinoma and adjacent non－cancerous tissue in the expression of Kazak

2.2 P63表达与食管鳞癌临床病理特征的关系

食管鳞癌中P63表达阳性率与年龄、性别、分化程度、淋巴结转移、TNM 分期进行统计学分析，结果如表3所示。

由表3可知：P63表达阳性率与年龄、性别、分化程度、淋巴结转移、TNM分期均无明显相关性（P＞0.05）。

P63表达阳性率与新疆哈萨克族食管鳞癌分化程度有关，（χ2＝14.286，P＜0.05）。

表3 P63蛋白表达与新疆哈萨克族食管鳞癌临床病理特征的关系Tab.3 The relationship of p63 protein and clinicopathological characteristics of esophageal squamous cell carcinoma in Xinjiang Kazakh

3 讨论

P63基因是1998年Yang等［4］在人类及大鼠基因组中发现的一个与P53同源的基因家族新成员，定位于3q27－3q29，在结构与功能上都与P53有高度的同源性，被认为是P53家族的新成员。P53的主要功能是诱导细胞周期停滞和凋亡，具有抗肿瘤作用［5］，而P63对于上皮干细胞的增殖、生存和上皮组织的形态发生等具有重要的意义［6］。研究表明［7］，P63基因高表达于许多上皮组织的基底层与生发层，且与鳞癌的发生关系密切。

最近一项研究表明［8］，食管癌中 miR－203基因可能通过抑制靶基因△Np63介导的信号通路抑制食管癌细胞增殖。在成人表皮角质形成细胞增殖、分化过程中，miR－203下游直接靶基因为△Np63，且在人类头颈部及肺部鳞状细胞癌中研究发现miR－203同样可以调控△Np63 m RNA和蛋白表达水平［9－10］，这些结果提示 P63的过度表达在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用，但具体的分子机制还不清楚，需要进一步深入的研究。

本研究首次利用组织芯片技术高通量的研究P63蛋白的表达，结果显示，新疆哈族食管鳞癌组织中的P63蛋白呈高表达，表达阳性率为83.5%，癌旁非癌组织中的阳性表达率为59.4%，两者阳性表达率统计学上有显著差异（P＜0.01），本实验中由于癌旁非癌组织的样本量较小（35例）在后续试验中讲一步扩大样本量进行研究。在食管鳞癌组织中P63表达明显高于癌旁非癌组织中的表达，且与肿瘤的分化程度有关，提示P63参与了新疆哈萨克族食管鳞癌的发生发展，然而，P63的高表达的是肿瘤发生的原因还是结果，尚需更进一步的研究。

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