反胶束体系中脂肪酶催化棉籽油制备生物柴油

左晓旭，李芳芳，陈芳，高剑峰

（石河子大学生命科学学院，石河子832000）

反胶束是一种由表面活性剂在含少量水的非极性溶剂中自发形成的透明或半透明的热力学稳定系统［1－2］。其内部可溶解水和其它水性分子，这些水性分子所形成的膜能将油水两相分开。高度分散的反胶束体系不仅为酶催化提供更大的相界面，且避免了酶和周围有机相接触，从而使酶保持较高活性［3］。

生物柴油是一种环境友好的可再生清洁燃料［4］，其最主要成分是脂肪酸甲酯。曹卫彬等［5］人测试了棉籽油生物柴油的燃烧和排放性能，结果表明生物柴油的含氧性具有促进燃料充分燃烧，可提高燃烧效率，有效改善柴油机碳烟排放。Xu Yuanyuan等［6］用乙酸甲酯代替甲醇作为酰基受体制备了生物柴油，实验结果表明乙酸甲酯及反应副产物三乙酸甘油酯对脂肪酶均没有抑制作用，但该工艺需要大量的脂肪酶（脂肪酶用量为原料油质量的30%），这使得它的工业化应用受到很大限制。Su Erzheng等［7］以固定化脂肪酶Novozym435为催化剂、碳酸二甲酯为酰基受体、石油醚为有机溶剂制备了生物柴油，在重复实验中，需要在每次反应后用丙酮洗涤Novozym435，5次反应后，Novozym435的相对活性仅为80%左右。利用酶法合成生物柴油具有反应条件温和、产物易回收、无污染物排放等优点心［8－11］，但是该方法也存在一些问题，由于甲醇等短链醇对酶等蛋白质有变性作用，因而过量的短链醇对酶催化反应有很强的抑制作用，使酶活性降低甚至失去活性。为此，研究人员提出了很多方法试图解决该问题，例如分步加入甲醇法，但该方法的甲醇加入量不易控制，而且不易在大规模生产过程中实现。

Marlinek等首次报道了被包围在AOT（丁二酸二辛酯磺酸钠）形成的反胶束系统中的胰凝乳蛋白酶，在异辛烷溶液中具有催化活性，这一发现使酶的应用范围迅速扩大到非水相［12］。到1986年已有30多种酶在反胶束系统中具有催化活性［13］，反胶束系统的出现使脂肪酶成为有机相催化中应用最广泛的酶［14－15］。聂开立等［16］用织布固定脂肪酶来生产生物柴油，邓利等［17］用固定化脂肪酶通过酯化和酯交换两种工艺对色拉油催化合成生物柴油进行了初步研究。李元元等［18］利用D10l作为载体，采用先吸附BD9－1所产脂肪酶后加戊二醛交联的固定化方法，以固定化脂肪酶催化棉籽油与甲醇转酯化反应合成生物柴油。唐功等［19］研究了反胶束体系中酶的催化反应，结果证明反胶束不仅可以溶解酶，而且还可以包埋细胞，从这个意义上讲反胶束是一种新的生物催化剂固定化技术。唐功等［20］利用AOT／正己烷反胶束体系催化合成己酸乙酯。刘伟东等［21－22］在 AOT／异辛烷反胶束体系中，用甲醇作为酰基受体制备生物柴油，用假丝酵母99－125脂肪酶催化合成生物柴油，结果表明AOT反胶束体系为Candida sp.99.125脂肪酶催化大豆色拉油合成生物柴油提供了合适的微环境。Sara M等［23］在AOT／异辛烷反胶束体系中，研究了角质酶催化甲醇制备生物柴油，结果酯转化率超过75%。但在AOT／异辛烷反胶束体系中，用碳酸二甲酯作为酰基受体来制备生物柴油还尚未见报道。

发挥新疆本地优势资源，以棉籽油为原料利用生物法合成生物柴油，是一种典型的新疆资源转化的处理方式。因此，本文采用棉籽油为原料，碳酸二甲酯代替甲醇作为酰基受体，以丁二酸二酯磺酸钠（AOT）／异辛烷反胶束体系作为脂肪酶的催化介质，制备生物柴油。考察了AOT浓度、W0、脂肪酶用量、缓冲溶液p H值、醇油摩尔比、反应温度等因素对脂肪酶催化合成生物柴油酯转化率的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

棉籽油：新疆石河子市新安棉油有限责任公司；碳酸二甲酯：分析纯；脂肪酶（100～400 u／mg）：Sigma公司；AOT（丁二酸二酯磺酸钠）纯度96%；异辛烷：色谱纯；高碘酸钾、碘化钾、浓硫酸均为分析纯。

1.2 实验仪器

DHG－9101－2S型电热恒温鼓风干燥箱，扬州鸿都电子有限公司；RS－232精密电子天平，上海恒平科学仪器有限公司；酸式滴定管、锥形瓶、碘量瓶、温度计、秒表等。

1.3 实验方法

1.3.1 AOT反胶束体系的制备

按照一定的比例先后向50 m L三角瓶中加入60 mmol／L AOT异辛烷溶液和溶有10 mg脂肪酶的缓冲溶液，在振荡器上振荡10 min，制成反胶束体系。

1.3.2基本反应体系

取50 m L三角瓶依次编号（如1～10号），在50 m L的三角瓶反胶束体系下依次加入1 g棉籽油和303.4μL碳酸二甲酯，用保鲜膜封口，然后放入30℃摇床振荡反应。在改变不同的反应条件（温度、含水量、p H、摇床缓冲液、摇床转速等）下进行实验。

1.3.3酯交换反应转化率的测定

甘油是油脂水解或酯交换反应的副产物，通过测定甘油含量的变化可以计算出酯交换反应的转化率。本实验采取高碘酸法来分别测定原料酸化油和酯交换反应产物中的甘油含量，计算公式如下：

上式中：M1为酯交换反应后产物中的甘油含量；M0为原料酸化油中甘油的含量。

1.3.4甘油含量的测定

用烧杯准确称取1 g测试样品，向其中加入50 m L的温度为90℃左右蒸馏水，并缓慢滴加10m L 30%H2SO4，滴加过程中要不停搅拌，搅拌5 min左右后，全部移入分液漏斗静置分层，下层甘油相转入100 m L的容量瓶中，并用适量水洗涤脂肪酸层，水层也转入容量瓶中，最后定容，待用。准确量取10 m L上述甘油溶液，放入250 m L的碘量瓶中，加入20 m L 0.02 mol／L的KIO4溶液，10 m L 3 mol／L的H2SO4溶液，盖好瓶盖，在室温下暗处放置30 min。然后加入2 g KI，再加水100 ml蒸馏水，析出的碘用0.2 mol／L的Na2S2O3标准溶液滴定，滴定至淡黄色时加入1 m L淀粉指示剂，继续滴至蓝色刚好消失为止。平行测定3次，并取10 m L蒸馏水代替样品做空白实验。

计算公式：

式（2）中：V0是空白实验消耗 Na2S2O3标准液的体积m L；V是测试样品消耗Na2S2O3标准液的体积m Ll；C是Na2S2O3标准液的浓度mol／L；M 是甘油的摩尔质量g／mol；W 是试样质量g。

2 结果与分析

2.1 表面活性剂浓度对转化率的影响

实验结果见图1。由图1可知：随AOT浓度增加，转化率上升，当AOT浓度控制在40 mmol／L时，转化率突然下降，可能是由于此浓度的AOT导致反胶束体系不稳定所致；之后随着AOT浓度增加，转化率逐渐升高，当AOT浓度为60 mmol／L时，转化率最高，即能维持反胶束的稳定又能保持酶的最高催化活性，继续增加AOT浓度，转化率降低。因此，在后续实验中采用的AOT浓度为60 mmol／L。

这表明：表面活性剂（AOT）的浓度关系到反胶束的形成和酶的催化活性，既要保证形成稳定的反胶束体系的同时还要考虑对脂肪酶的毒害作用。AOT浓度太低，无法形成反胶束溶液，而AOT浓度太高，对脂肪酶有毒害作用，抑制酶的活性，在反胶束体系中合理的控制好表面活性剂浓度，有利于酶催化反应。

图1 AOT浓度对酯转化率的影响Fig.1 Effect of concentration of AOT on transesterification rate

2.2 含水量对转化率的影响

结果见图2。由图2可知：随着 W0从3到5，转化率下降，但继续增大到W0为7时，转化率达到最大为64.1%，过此点，随着 W0的增加，转化率降低。从反胶束的构成角度来说，含水量的高低决定着反胶束水池直径的大小。W0较小时，反胶束水池尺寸小，不能完全容纳脂肪酶分子，导致部分酶分子暴露在有机溶剂中失活，W0值太大，反胶束尺寸增大，酶分子虽然能完全增溶于反胶束水池内，但反胶束的稳定性下降。随着反应进行，反胶束之间不断碰撞，导致胶束重新组合，引起部分酶失活。从脂肪酶催化活性的角度而言，当W0小于7时，整个反应体系含水量低，反胶束水池中的绝大部分水以表面活性剂结合，用于反胶束的构成，而保持反胶束里酶活性构象所需要的自由水减少，影响酶活力的提高，且形成的反胶束的尺寸不能完全包含酶分子，导致酶的活力不高，随着W0值的增大，维持酶构象的自由水增多，酶的活性增大，但 W0过大，形成的反胶束不稳定，容易受到剪切力的破坏，导致酶分子外露而失活。因此，实验的最佳含水量值W0为7。

这表明：水与表面活性剂的质量比（W0）决定了反胶束介质的结构稳定性，同时决定了反胶束尺寸的大小，水溶性的脂肪酶分子增容到反胶束的水池内，形成了微水环境，避免了酶分子直接和有机溶剂接触而带来酶的失活，最佳的水含量应该是使得反胶束的大小尺寸和酶分子的大小相一致。

图2 水与AOT质量比对酯转化率的影响Fig.2 Effect of ratio of water and AOT on transesterification rate

2.3 脂肪酶用量对转化率的影响

结果见图3。由图3可知：转化率首先是随着酶用量的增加而有所下降，但当体系中酶用量达到10 mg时，转化率上升至最高点67.7%，再继续增加脂肪酶的用量，转化率有所下降，因此，在水／AOT／异辛烷反胶束体系中，在本实验体系中均采用10 mg脂肪酶。

这表明：在反胶束体系中，酶量应该是能正好完全能包容在反胶束水池中，脂肪酶量的提高，可以加快反应速度，提高反应的转化率，当达到一定量后，由于酶促界面的限制，不会再提高转化率。

图3 用酶量对转化率的影响Fig.3 Effect of lipase amount on transesterification rate

2.4 缓冲液pH值对转化率的影响

结果见图4。由图4可知：随着p H值增加，转化率升高，p H值为6时到达63.9%，随后转化率又随着p H值得增加而降低。本实验采用p H值为6的缓冲液。

这表明：脂肪酶分子上有许多酸性、碱性氨基酸的侧链基团，它随着p H的变化处于不同的解离状态。因此，反胶束体系中缓冲液p H值影响着脂肪酶活性中心集团的解离，从而影响着脂肪酶的催化活性。

图4 pH值对酯转化率的影响Fig.4 Effect of pH value on transesterification rate

2.5 底物摩尔比对转化率的影响

结果见图5。由图5可知：随着醇和油的摩尔比增大，转化率起初是降低，当碳酸二甲酯和油的摩尔比继续增大达到3∶1时，酯转化率开始上升达到最高为63.1%，但当碳酸二甲酯与棉籽油摩尔比大于3后，再继续增大碳酸二甲酯与棉籽油的摩尔比，脂肪酸甲酯收率反而降低，这可能是由于过量的碳酸二甲酯对脂肪酶的催化活性有一定的抑制作用。因此，在后续实验中甲醇与油的摩尔比选为3∶1较为理想。

这表明：底物对酶催化反应会出现底物抑制现象，底物浓度过高，会抑制酶的催化活性，而过低又无法使反应向正方向进行。

图5 醇油摩尔比对转化率的影响Fig.5 Effect of molar ratio of dimethyl carbonate and cottonseed oil on transesterification rate

2.6 反应温度对转化率的影响

结果见图6。由图6可知：在较低的温度范围内，随温度升高，酯转化率升高，温度为30℃时，转化率达到了最高为62.5%，超过30℃后，酯转化率相对有所降低，一方面可能是反胶束结构不稳定；另一方面是温度升高改变了酶的活性构象，酶活降低。因此，在实验中采用30℃为最佳的反应温度。

这表明：温度是一个相对比较容易影响脂肪酶活性的外界因素，在反胶束体系中控制一定的温度范围，既能提高脂肪酶的活性，又能维持反胶束结构的热稳定性。

图6 温度对酯转化率的影响Fig.6 Effect of reaction temperature on transesterification rate

2.7 摇床转速对转化率的影响

实验结果见图7。由图7可知：随着转速增加，酯转化率缓慢升高，到140 r／min时，酯转化率达到最大为64.1%，但随着转速的进随着转速的增加，酯转化率降低。转速升高使更多的底物与反胶束中的酶接触，增加了酶的活性，但随着转速的进一步增加，反胶束的稳定性可能受到影响，各胶束之间的碰撞几率增加，导致反胶束之间重新并合和形成，使得部分酶在有机溶剂中失活。因此，在实验中控制摇床速度在140 r／min较为合适。

这表明：在反胶束体系下脂肪酶催化棉籽油制备生物柴油的过程中，摇床的转速影响着酶催化反应的传质和传热，增加底物和酶的接触几率，同时也影响着反胶束介质的结构稳定性。控制合适的摇床转速不仅能保证较好的传质传热，还能维持反胶束介质的稳定性，对脂肪酶的活性有重要的影响。

图7 转速对酯转化率的影响Fig.7 Effect of rotate speed on transesteriflcation rate

3 结论与讨论

（1）AOT反胶束体系为脂肪酶催化棉籽油合成生物柴油提供了合适的微环境。

（2）AOT／异辛烷反胶束体系下以碳酸二甲酯为酰基受体用脂肪酶催化棉籽油与碳酸二甲酯进行酯交换反应制备生物柴油的优化反应条件为：AOT浓度为60 mmol／L，含水量 W0为7，碳酸二甲酯与棉籽油摩尔比为3∶1，脂肪酶用量为10 mg，缓冲液p H为6，反应温度30℃，摇床转速140 r／min。在以上条件下，酯转化率可达到67.7%。

（3）在AOT／异辛烷反胶束体系中以碳酸二甲酯为酰基受体合成生物柴油目前还尚未见报道。虽然本实验在反胶束体系中以碳酸二甲酯作为酰基受体制备生物柴油的转化率比传统体系或以甲醇为酰基受体的转化率低，但是碳酸二甲酯不存在短链醇对脂肪酶的毒害作用。实验得到的参数可作为酶催化棉籽油制备生物柴油扩大实验设计提供工艺参考，有一定的理论研究价值和实际应用价值。

（4）目前对利用反胶束体系制备生物柴油的研究还相对较少，因此以碳酸二甲酯作为酰基受体在反胶束体系中用游离脂肪酶催化棉籽油制备生物柴油的方法还有很大的研究空间。今后还需对反胶束体系的反应动力学进行更深入的研究，以寻求提高酯转化率的解决办法。

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