棉花GhFTL1基因启动子的克隆及序列分析

张定国，黄先忠，东锐，郑银英，崔百明

（石河子大学生命科学学院／农业生物技术重点实验室，石河子832003）

FT（Flowering Locus T）基因是光周期途径中决定植物开花的重要因子。CO和FT基因在植物开花中起着关键作用，CO基因在长日照下能够诱导叶片FT基因的表达，当FT基因在茎尖特异表达时可以促进花芽分化。FT蛋白（诱导开花的成花素信号分子）从叶片经过韧皮部长距离运输到达茎顶端分生组织后，与顶端组织特异表达的Flowering Locus D（FD）基因编码产物之间结合，形成一种蛋白复合体，共同促进下游成花基因Apetala 1（AP1）、Leafy（LFY）等的表达，从而促进植物开花［1］。棉花Gh FTL1基因已经被克隆，系统进化分析表明Gh FTL1属于FT亚家族成员［2］。

染色体步移技术（Genome walking）是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。热不对称交错PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR，TAILPCR）技术［3］因快速、简单、高效等优点而备受青睐，目前已有大量成功报道［4］。Wang 等［5］利用 TAIL－PCR法分离了小球藻硝酸还原酶基因5′端侧翼序列，将其与GUS基因融合并表达，结果显示该侧翼序列能启动GUS基因的表达，该片段含有硝酸还原酶基因转录表达所必要的启动子元件。财音青格乐等［6］通过此方法，成功地克隆了大豆种子特异性启动子序 列 （约 700 bp）。李 秋 莉 等［7］也 应用TAIL－PCR法成功地克隆了辽宁碱蓬BADH基因的启动子片段。Liu等［8］报道，TAIL－PCR 方法通常可以扩增到0.2～2.0 kb的片段。因此，TAILPCR法是克隆未知启动子的一种有效、简便的方法。

本实验室已经获得GhFTL1基因的序列［2］，为了研究Gh FTL1基因自身启动子的功能，利用TAIL－PCR方法从棉花基因组中分离了长度为715 bp的该基因序列片段，并对已得到的序列片段序列进行分析，旨在为进一步研究该启动子的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1植物材料

实验材料为新疆陆地棉品种新陆早33。

1.1.2菌株和质粒

大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌GV3101、植物表达载体pCAMBIA1301、p35S：：Gh FTL1为本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

棉花DNA提取采用CTAB法。

1.2.2引物的设计及合成

根据已知棉花FT同源（登录号HM631972）基因的序列，设计引物（华大基因合成）（表1）用作PCR扩增。

表1 TAIL－PCR引物Tab.1 Primers of TAIL－PCR

1.2.3 pGhFTL1启动子片段的克隆

TAIL－PCR第1轮扩增：以棉花叶片DNA为模板，在50μL的反应体系中加入DNA模板2μL，5μL 10×LA Buffer，8μL d NTP Mixture，0.5μL 5U LA Taq DNA聚合酶，以AD1为正向引物，SP1为反向引物各1μL，dd H2O补齐。第2轮扩增：将第1轮PCR反应液稀释100倍后，取1μL作为第2轮PCR反应的模板，5μL 10×LA Buffer，8μL d NTP Mixture，0.5μL 5 U LA Taq DNA聚合酶，以AD1为正向引物，SP2为反向引物各1μL，dd H2O补齐。第3轮扩增：将第2轮PCR反应液稀释100倍后，取1μL作为第3轮PCR反应的模板，反应体系与第2轮的相同。取上述各步PCR反应液在1%的琼脂糖凝胶上检测，割下目的条带，利用凝胶回收试剂盒纯化后，将回收产物与载体p GEM－T Easy连接。连接产物转化DH5α感受态细胞，在涂有IPTG／X－gal及氨苄抗生素的LB平板上通过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆于LB培养基中过夜摇菌，小量提取质粒经酶切鉴定后，将阳性克隆交由北京华大基因公司测序。

第1轮反应程序：94℃1 min，98℃1 min 1个循环；94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 5个循环；94℃30 s，25℃3 min，72℃2 min 1个循环；94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，44℃1 min，72℃2 min 15个循环；72℃10 min 1个循环。

第2轮反应程序：94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，44℃1 min，72℃2 min 15个循环；72℃10 min 1个循环。

第3轮反应程序：同第2轮反应程序。

1.2.4 GhFTL1启动子的验证

为了验证所克隆的片段是GhFTL1的启动子，从已克隆的启动子片段中设计2个引物P－Jian－F－1：5′－TGGGGTGTGTATGCAGTTGT－3′，P－Jian－F－2，5′－GAATCACAGAAAG GGCAAGC－3′分 别和TAIL－PCR中所用到的SP1引物进行PCR验证，以棉花叶片DNA为模板，在10μL反应体系中加入DNA模板0.5μL，1μL 10×Hotmaster Buffer，1μL d NTP Mixture，0.1μL 2.5 U Hotmaster Taq DNA 聚合酶，以 P－Jian－F－1和 P－Jian－F－2为正向引物，SP1为反向引物各0.5μL，dd H2O补齐。

PCR反应程序为：94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，44℃1 min，72℃2 min 15个循环；72℃10 min 1个循环。

2 结果与分析

2.1 GhFTL1启动子片段的克隆与测序

利用引物 AD1、AD2、AD3和SP1、SP2、SP3分别进行3组3轮PCR，第3轮扩增出约为800 bp的产物（图1），将第3轮PCR产物回收纯化后连接到p GEM－T载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆提取质粒经EcoRⅠ酶切鉴定（图2）。挑选其中阳性克隆进行测序，将800 bp的测序结果经DNAstar软件分析，和已知的FT序列比对，该序列确实为Gh FTL1上游启动子序列。

图1 Genome Walking PCR方法经过三轮扩增后PCR片段Fig.1 PCR fragments amplified by using genome Walking PCR

图2 pGEM－T载体上的质粒酶切鉴定Fig.2 The restriction enzyme digestion analysis of pGEM－T vector

2.2 GhFTL1启动子的验证

从已克隆的启动子片段中设计2个引物，分别与TAIL－PCR中所用到的SP1引物进行PCR验证。将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。电泳结果（图3）与预期结果一致。

图3 PCR验证启动子Fig.3 PCR validation promoter

2.3 GhFTL1启动子序列分析

通过TAIL－PCR，获得715 bp的启动子片段，经Program NSITE（Softberry Inc.）序列分析表明，在该片段起始密码子104 bp处有1个典型的TATA box，预测的转录起始位点在起始密码子前69 bp处，除了有TATA box、CAAT box等基本元件外，还含有与光调节有关的元件，GT－1和SP1，另外还有如 CAr G box、GT－1＃Box7、telo－box、GS1b AC box 1等其他一些元件（图4）以及逆境胁迫相关等的顺式作用元件，通过同源克隆法先后从小拟南芥中克隆了一些耐逆基因，这些基因的启动子中有许多逆境胁迫元件［9－11］。

植物开花受环境因素和发育状态的控制，在拟南芥中几种开花信号，包括光周期应答，集中在FT基因的转录调节水平上。当拟南芥FT在长日照条件的诱导下FT在叶片的维管组织中转录，几种转录抑制子参与了FT的调节，尽管这些元件对FT调节的重要性没有完全得到证明，但FLC的MADS box与SVP形成的复合物与FT启动子近端区域和包含有CAr G boxe的第1个内含子有一定的联系［12］。FT的表达受FLC表达的抑制，这种抑制受FT启动子的介导，在FT的启动子中有1个CArG box。拟南芥FT基因编码的蛋白产物是可以长距离转运的成花激素，可从叶片运输到芽顶端，优先在芽顶端表达的FD，对FT促进开花是必需的，FD和FT通过蛋白互作，激活花分生组织特异性基因AP1，从而促进开花［13］。

GT元件是一个光应答元件。GT元件最初是在豌豆叶片rbcS－3A基因启动子中被鉴定出来，其核心序列为5′－GTGTGGTTAATATG。GT－1是一种蛋白，其可与光调节基因的启动子相互作用，分布在cab－E启动在的7个不同为点上。在cab－E基因的启动子内GT－motifs是通过GT－1把他们结合在一起，rbcS－3A基因启动子与GT－1的结合位点序列和cab－E基因的启动子与GT－1的结合位点序列一致［14］。紫外光能能增强Tdc启动子的表达，通过紫外光证明了GT－1在Tdc中调节的功能。PsGS1b在整个植物的维管组织中表达，在不同的新陈代中铵盐的重新利用中起重要作用，还可在酵母、拟南芥和松树的细胞中激活转录［15］。分析了PsGS1b的启动子的403 bp的序列在该启动子转录起始位点上游的1个区域含有大量的AC元件，这个区域被称为GS1b AC box 1，其包含3种AC元件，AC元件能调节基因的表达［16］。siteⅡ和telobox是一种顺式调节元件，与基因的分生表达有关。细胞循环的众多基因启动子中siteⅡ和telo－box之间存在保守关联，包括几种细胞循环有关的基因和编码核糖体蛋白的拟南芥153基因。植物在拟南芥启动siteⅡ元件的控制下可观测到GUS基因的分生表达，而启动子中的telo－box能增强这一表达。telo－box在拟南芥中编码延长因子基因的启动子中首次被观测到，后来在几种植物的RP启动子中也发现了这一元件［17］，已经确定telo－box可激活细胞循环中一组基因的诱导表达或过量表达［18］。telobox不能完全依赖自身来激活基因的表达，但要同其他顺式激活序列协同作用才能发挥作用。因此，初步推断此序列片段可能是Gh FTL1基因的启动子。

图4 pGhFTL1启动子的序列分析Fig.4 Sequence analysis of Cotton pGhFTL1 gene promoter

3 结论与讨论

在转基因棉工程中，有关启动子在棉花中的研究较多，但是大多数采用组成型启动子。其中所应用的表达载体基本上是利用外源型启动子Ca MV 35S。Tail－PCR、SiteFinding－PCR 等克隆技术的发展，加快了启动子克隆的进程。近年来，世界各国正在加快棉花基因组的测序，并且随着克隆方法的不断改进，棉花基因组中各种类型的启动子已被大量克隆测序，其功能也在一定程度上得到验证。在棉花基因工程研究中，除利用外源启动子外，越来越多的棉花内源启动子被开发出来，利用棉花内源启动子本身的特性来改良基因在棉花中的表达。

TAIL－PCR技术［13］因快速、简单、高效等优点而备受青睐，本实验采用TAIL－PCR方法克隆了Gh FTL1启动子片段。特异性引物设计基本遵循一般PCR 引物设计原则［18］，为了提高 TAIL－PCR扩增的特异性，本实验进行了两处重要改进：1）3条特异引物退火温度均高于60℃，低于72℃，且3条特异引物sp1、sp2、sp3退火温度依次升高，使第1轮及第2轮TAIL－PCR中的非特异扩增片段不能进一步有效扩增，进而提高终产物扩增的特异性；2）特异性引物3′末端5～10个碱基中适当提高G、C含量，尤其是3′末端5个碱基设计时不要出现二联体或三连体的A或T，同时增加G或C碱基的个数，这样可大幅减少特异引物的自身非特异扩增。本实验采用改良的TAIL－PCR法取代5′RACE方法分离基因的5′端序列，为全长基因克隆提供了一种新选择。改良后的TAIL－PCR技术很大程度地弥补了原TAIL－PCR技术非特异扩增高、成功率低的缺陷，通过随机引物的筛选及特异引物设计的改进，极大地提高了TAIL超级循环中特异扩增的效率，操作简单，3轮超级循环在1 d内就可完成，因此该技术省时省力、快速高效。改良后的TAIL－PCR技术对试剂、仪器等的要求相对较低，一般实验室均可满足要求，因此该技术是进行全长基因克隆的理想选择，具有较广阔的应用前景。

对克隆的启动子片段进行序列分析，在此启动子上不仅含有TATA box和CAAT box基本元件，而且含有与光调节有关的元件，如GT－1和SP1，另还外存在一些其他元件，在该片段在起始密码子104 bp处有1个典型的TATA box，预测的转录起始位点在起始密码子前69 bp处。

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