浙江省7个特用玉米品种的SSR 纯度检测

吕学高，楼肖成，朱正梅，赵军华

(浙江省东阳玉米研究所，浙江 东阳 322105)

SSR (simple sequence repeats)标记因具有快速、准确，信息含量高、呈共显性分离、易于分析、重复可靠等优点，被广泛用于玉米指纹图谱构建、品种真实性鉴定以及纯度检验［1-3］。利用SSR指纹技术鉴定区域试验品种的一致性和真实性在普通玉米中已于2002年开展，并出台了相应标准，2006年在鲜食甜、糯玉米上也开展了此项工作［4］。作者以浙江省4个甜玉米和3个糯玉米品种为材料，选用38 对玉米SSR 核心引物分析检测纯度，以期为浙江特用玉米新品种保护和种子生产提供参考，为农业生产、粮食安全和农民利益提供帮助。现将有关结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

7个特用玉米品种，4个甜玉米是超甜3号(三交种)、超甜4号、浙甜6号、浙甜8号;3个糯玉米分别是浙糯玉1号 (三交种)、浙糯玉3号、浙糯玉4号。38 对引物参照北京农林科学院玉米研究中心核心引物筛选［2，5］(表1)，由上海生工生物工程(上海)有限公司合成。SSR 标记在浙江省农科院作物与核技术应用研究所分子育种中心检测。

1.2 方法

玉米基因组DNA 提取。随机选取超甜3号和浙糯玉1号玉米种子15粒，其余品种10粒，将玉米种子置于20 (夜12 h)～26℃ (昼12 h)培养箱培养至2 叶1 心，取第2 叶片放入1.5 mL 离心管研磨，采用CTAB 法提取玉米总DNA。

SSR 检测。PCR 扩增反应体系10 μL，反应体系组成:1 μL 10×Buffer、0.6 μL 25 mmol MgCl2、0.8 μL dNTP (各2.5 mmol)、0.05 μL Taq 酶(5 U·μL-1)、2 μL DNA 模板、2 μL SSR 引物、ddH2O 定容。反应程序:94℃预变性2 min;94℃变性30 s，55～60℃退火40～60 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃延伸5 min［2，5］。

电泳检测:3%琼脂糖凝胶 (0.5× TBE+EB)电泳，10 μL PCR 产物点样，恒压300 V，电泳30～60 min，AlphaImager EP 凝胶成像系统检测。

2 结果与分析

2.1 多态性引物筛选

38 对SSR 引物在7个品种中共筛选出具有多态性差异引物23对，其中 umc1125y3、bnlg1520K1、phi233376y1、phi041y6 在4个以上品种中均表现多态性差异，差异多态性频率较高。umc2007y4、bnlg1702k1、umc1545y2、bnlg1671y17、umc1429y7 可作为超甜 3号品种纯度检测;umc1125y3、umc1506k12、umc2115k3 可作为超甜4号品种纯度检测;umc1125y3、umc2115k3、phi233376y1 可作为浙甜 6号品种纯度检测;umc1125y3、bnlg240k1、phi080k15、umc2115k3、phi299852y2、phi041y6 可作为浙甜8号品种纯度检 测;umc1125y3、umc1999y3、phi233376y1、umc2163w3 可作为浙糯玉1号品种纯度检测;umc1125y3、umc1429y7 可作为浙糯玉3号品种纯度 检 测;bnlg1702k1、umc1999y3、umc1429y7、phi299852y2、umc2160k3、phi233376y1、phi041y6可作为浙糯玉4号品种纯度检测。

表1 杂交种纯度分析的引物

2.2 杂交种纯度检测

由表2 可以看出，7个特用玉米品种超甜3号、超甜4号、浙甜6号、浙甜8号、浙糯玉1号、浙糯玉3号、浙糯玉4号的SSR 平均检测纯度分别为87%，96.8%，96.5%，98.9%，89.3%，95.8%和99.0%。其中超甜3号和浙糯玉1号为三交种，单个引物位点检测纯度最低值分别为78.6% 和66.7%。由于SSR 检测缺乏三亲本完全差异位点，对无差异位点是否来自双亲遗传难以判定，可能降低该位点检测纯度。

表2 杂交种纯度的检测结果

3 小结与讨论

选用的38 对玉米SSR 引物对7个特用玉米品种进行纯度检测结果，共筛选差异性引物23 对，其 中，umc1125y3、bnlg1520K1、phi233376y1、phi041y6 等引物在多个品种中表现多态性。经SSR检测7个特用玉米品种超甜3号、超甜4号、浙甜6号、浙甜8号、浙糯玉1号、浙糯玉3号、浙糯玉4号的纯度分别为87.0%，96.8%，96.5%，98.9%，89.3%，95.8%和99.0%。

玉米SSR 标记丰富的多态性和目前已开发出2 000 多对玉米SSR 引物数量，为玉米杂交种纯度鉴定提供保障。影响杂交玉米种子纯度，通常有多种综合因素，利用一种SSR 引物可能不能区分开是什么原因引起的混杂，因此选取那些扩增条带位置各不相同的引物，将它们组合起来扩增得到的特异分子标记，可以大大提高检测的准确度［6-8］。

SSR 标记检测方法是在DNA 分子水平上的检测手段，SSR 多态性是与性状连锁的DNA 标记，与性状间有一定的遗传距离，因而在繁殖过程中可能出现交换导致基因重组，从而造成检测的误差。表现在检测结果上，分子鉴定获得的杂交种纯度一般低于常规方法。要解决这一问题，可通过大量样本的检测分析，求出校正纯度值的回归方程，计算出更准确的纯度值［3］。

目前国内外玉米生产上普遍利用单交种，这类杂交种遗传性状稳定，杂交优势强，增产显著。三交种的整齐度不如单交种，制种技术及环节也比单交种复杂，但制种产量比单交种成倍提高，且在特用玉米上有改善品质、提高抗性等优势，这类杂交种在国内外仍有少量利用［9］。三交种是一个杂合程度较大的遗传平衡群体，具有较复杂的遗传基础，目前SSR 分子标记技术应用于三交种测定的研究报道较少，如三个亲本SSR 完全差异引物的大量筛选、基因交换重组比例、测定群体的扩大等研究有待深入。

［1］邱红波，戴保威，彭中华.利用SSR 标记对贵州主要玉米种质进行遗传多样性分析［J］.浙江农业学报，2011，23(4):667-670.

［2］赵久然，王凤格，郭景伦，等.中国玉米新品种DNA 指纹库建立系列研究Ⅱ.适于玉米自交系和杂交种指纹图谱绘制的SSR 核心引物的确定［J］.玉米科学，2003，11(2):3-5，8.

［3］盖树鹏，盖伟玲，王日新.6个玉米杂交种种子纯度的SSR 鉴定［J］.种子，2010，29 (7):44-47.

［4］俞琦英，包斐.SSR 指纹技术在甜、糯玉米区试中的应用［J］.种子，2010，29 (7):55-57，69.

［5］赵久然，王凤格.玉米品种DNA 指纹鉴定技术:SSR 标记的研究与应用［M］.北京:中国农业科学技术出版社，2011.

［6］辛景树，郭景伦，贾希海.SSR 技术在玉米种子纯度鉴定上的应用 (上)［J］.种子科技，2005 (3):155-157.

［7］辛景树，郭景伦，贾希海.SSR 技术在玉米种子纯度鉴定上的应用 (下)［J］.种子科技，2005 (4):219-221.

［8］袁进成，刘颖慧，郭建东.应用SSR 标记技术鉴定玉米杂交种纯度［J］.中国种业，2009 (9):46-47.

［9］刘必善，向发洪，田发端，等.玉米三交种主要特点及配组技术［J］.湖北农业科学，2002 (5):46-48.