10个甜、糯玉米品种SSR 指纹库的建立及应用

包 斐，王桂跃

(浙江省东阳玉米研究所，浙江 东阳 322100)

随着我国玉米产业的发展，玉米新品种越来越多，有关品种遗传背景、遗传关系的研究逐渐深入到分子水平。简单重复序列 (simple sequence repeat，SSR)是一种普遍存在于生物基因组中的DNA 片段，并且在不同生物或者相同生物的不同亚种中存在多样性。SSR 在玉米基因组中也广泛存在，利用SSR 两端的保守序列来设计引物，通过PCR 扩增和电泳检测，可以将这种多样性用图谱的形式表现出来［1］。SSR 指纹库是将玉米品种不同位点的SSR 多样性数据整合、记录和编码，使之成为在一定程度上能够描述该品种遗传特性的数据库。试验通过构建10个甜、糯玉米杂交品种的F1代及其亲本的SSR 指纹库，探讨数据库构建的数据要素，分析数据库扩展及其在纯度分析、遗传相似性研究中的应用，以便为甜、糯玉米种质资源的遗传分析提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

参试材料为浙江省甜、糯玉米审定品种浙甜6号，浙甜8号，浙甜9号，超甜135，超甜4号，浙糯玉2号，浙糯玉3号，浙糯玉4号，浙糯玉5号，以及2010-2011年省区试优秀参试品系花甜糯072。均由东阳玉米研究所选育并提供。

1.2 引物

参考不同引物在玉米指纹库构建、品种聚类分析中的应用情况及在使用中的表现情况综合选择了40 对引物 (均可在www.MaizeGDB.com 上搜索到)作为SSR 指纹库的建库引物 (表1)。

表1 40 对适合信息库构建的SSR 引物

1.3 DNA 提取及电泳方法

采用CTAB 法提取植株叶片总DNA。运用毛细管荧光电泳技术检测PCR 扩增产物，获得SSR图谱数据，并整理构建各试验材料的SSR 指纹库。

2 结果与分析

2.1 SSR 指纹库

根据SSR 扩增产物的电泳图谱，在有谱带(或特征峰，以下均称谱带)的地方记为1，无谱带的地方记为0，获得各试验材料的SSR 指纹库。表2 为各试验材料的SSR40个引物中的2 对引物图谱信息 (由于数据库较大，仅列举2 对引物图谱信息)。

表2 各玉米品种及其亲本材料在2个引物位点的SSR 指纹

表2 可以看出，本试验在引物umc1705w1 位点共检测出了6个等位变异，在引物umc1999Y3位点共检测出了4个等位变异。各引物等位位点以该位点特征谱带的片段大小来命名，不同试验材料扩增图谱数据以0，1 的数据形式对号入座。

2.2 SSR 指纹库的应用

2.2.1 纯合度分析

自交系材料在其选育过程中由于逐代自交，各等位基因趋于纯合，纯合程度越高该自交系越稳定。因为基因组的庞大和等位基因的复杂多样，一般对于自交系纯合程度很难用一个明确的指标进行衡量。试验在SSR 指纹库的基础上，计算SSR 纯合引物位点占所有检测引物位点的比例，尝试对各试验材料的纯合度进行分析。

从表3 可以看出，亲本自交系比单交种纯合度高，纯合度最高的是浙糯玉2号的父、母本和浙糯玉3号的母本，达到97.4%;纯合度最低的是浙甜9号的父本为73.0%。单交种的纯合度主要受父母本共同拥有的等位基因数的影响。纯合度最低的是浙甜6号，为35.1%，最高为花甜糯072，达到67.6%。

表3 各玉米品种及其亲本的纯合度

2.2.2 筛选出可用于品种纯度鉴定的SSR 引物

在单交种生产过程中，由于亲本种子的混杂而影响单交种种子纯度的情况时有发生，筛选出具有双亲互补带型的SSR 引物，并利用其对单交种种子进行检测，可以直接对种子进行纯度测定，快速高效的检测出单交种中的亲本混杂［2］。试验在SSR指纹库的基础上，筛选出对各品种具有双亲互补带型的SSR 引物2 组 (表4)，用于检测该品种种子的纯度，其中第2 组引物作为补充引物。

表4 适用于玉米单交种纯度检测的特异引物

3 小结与讨论

目前SSR 指纹库数据的记录方法主要有2种，一种基于PAGE 凝胶电泳，其图谱数据是根据特征谱带的数量及其相互位置确定，以0，1 表示;另一种是在引物末端加入荧光标记，并利用毛细管荧光电泳检测出扩增产物的片段大小，并直接记录特征产物的片段大小作为图谱数据。PAGE 凝胶电泳检测不同样品DNA 片段大小是通过与Marker 比较得出，但不可能每个泳道都加入Marker，所以片段大小只能用肉眼比较估测，因此数据的准确性受到一定的影响。而荧光电泳通过DNA 分析仪能够准确的得出DNA 片段的大小，准确性更高，同时由于确定了各个引物的BIN，所以不同批次，不同时间的检测数据均能够很好的整合到数据库中［1-3］。本试验中SSR 指纹以0，1 记录，但各引物等位位点谱带的大小已经确定，便于不同的图谱数据对号入座，这种记录方式除较普通的0，1 指纹更容易数据整合外，还有利于数据进一步的开发利用。

试验结果显示，浙甜9号父本和超甜135 母本的纯合度相对较低，说明这2个自交系可能存在一定程度的混杂退化，需要引起重视并进行必要的提纯工作。亲本自交系的纯合程度直接影响了F1代的杂种优势，利用SSR 指纹库数据计算纯合位点的比例，可直观反映出一个自交系材料的纯合度，用于长期监测自交系材料的稳定性情况。

运用SSR 标记对玉米单交种的纯度测试已经在国内多个实验室获得成功［4-7］，与RFLP 相比效率更高［8］。试验筛选出2 对适合玉米单交种纯度检测的SSR 特异引物，对制种过程中产生的亲本混杂的情况能够很好的进行测定，与传统的田间观察相比较而言准确性更高，速度更快，能大大提高检测效率。

SSR 用于真伪鉴定已经在不同生物种群开展［3，9］。目前玉米品种的真伪鉴定，需要通过品种DUS 测试来认定。利用SSR 多样性对品种真伪进行鉴定，需要严格筛选建库引物，明确界定入库数据的标准，建立品种SSR 指纹库，并结合形态性状的鉴定结果来综合说明［10-11］。本试验建立的SSR 指纹库在各个引物位点上检测到的等位基因数量有限，需进一步增加检测材料，将可能出现的新等位变异补充到现有的引物位点内，并逐步使入库数据更加规范化和标准化，为品种的真伪鉴定和遗传分析，提供帮助。

［1］李秀平，姜丽静，刘娜.SSR 分子标记技术及其在构建玉米DNA 指纹库上的应用［J］.现代农业科技，2010(16):47-49，52.

［2］王凤格，赵久然，郭景伦.中国玉米新品种DNA 指纹库建立系列研究Ⅰ.玉米品种纯度及真伪鉴定中SSR 技术标准实验体系的建立［J］.玉米科学，2003，11 (1):3-6.

［3］Huahg J A，L J L，Tan Y P，et al.Tea plant microsatellite genotyping by capillary electrophoresis with four-color fluorescent detection technique ［J］.Life Science Research，2009，13 (3):251-257.

［4］盖树鹏.玉米品种纯度SSR 鉴定与田间鉴定的相关性［J］.华北农学报，2010，25 (增刊):28-31.

［5］王凤格，赵久然，王璐，等.适于玉米杂交种纯度鉴定的SSR 核心引物的确定［J］.农业生物技术学报，2007，15(6):964-969.

［6］沈童伟，陆徐忠，刘勋辉，等.SSR 标记鉴定玉米品种真实性及纯度的研究［J］.安徽农业科学，2009，37 (19):8904-8908，8913.

［7］盖树鹏，盖伟玲，王日新.6个玉米杂交种种子纯度的SSR 鉴定［J］.种子，2010 (7):44-47.

［8］Smith J S C，Chin E C L，Shu H，et al.An evaluation of the utility of SSR loci as molecular markers in maize (Zeamays L.):Comparison with data from RFLPs and Pedigree ［J］.Theor Apply Genetics，1997，95:43-48.

［9］黄成志，黄文章，严明建，等.利用SSR 分子标记鉴定杂交水稻真伪与纯度［J］.安徽农业科学，2009，37 (8):3437-3438.

［10］沈童伟，陆徐忠，刘勋辉，等.SSR 标记鉴定玉米品种亲子关系的研究［J］.安徽农业科学，2009，37 (25):12347-12350，12360.

［11］杨留启，杨文鹏，王明春，等.12 份糯玉米自交系的SSR标记多态性和分子分类研究［J］.贵州农业科学，2009，37 (8):1-3.