冬虫夏草中游离麦角甾醇的研究

石岩，肖新月*，程显隆，魏锋，赵英永，林瑞超

（1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.西北大学陕西省生物医药重点实验室，陕西 西安 710069）

冬虫夏草中游离麦角甾醇的研究

石岩1，肖新月1*，程显隆1，魏锋1，赵英永2，林瑞超1

（1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.西北大学陕西省生物医药重点实验室，陕西 西安 710069）

目的：建立冬虫夏草药材中麦角甾醇的RP-HPLC含量测定方法。方法：冬虫夏草药材粉末经甲醇超声提取后，用RP-HPLC测定。采用Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，流动相为甲醇－水（98∶2）；流速为1mL·min－1；检测波长为282nm。结果：麦角甾醇进样量在0.0 427 2～0.427 2μg与峰面积呈良好的线性关系（r＝0.999 9）；麦角甾醇的平均回收率为98.7%（n＝6）。结论：采用建立的RP-HPLC方法测定冬虫夏草药材中麦角甾醇的含量，方法灵敏、快速、准确。

冬虫夏草；含量测定；反相高效液相色潽法；质量控制；麦角甾醇

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.寄生在蝙蝠娥科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，四川、青海、西藏、云南、贵州等地均有分布，是我国名贵中药材，对于肺结核、痰血、气喘、盗汗、腰酸背痛，阳痿和遗精等病症均有疗效。据报道，冬虫夏草中含粗蛋白、粗纤维、碳水化合物、脂肪、麦角甾醇及其氧化物、D-甘露醇、硬脂酸、尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤等［1-3］。麦角甾醇（ergosterol），又名麦角固醇，是脂溶性维生素D2的前体，其次生代谢产物可产生麦角甾醇氧化物。甾体类成分对真菌有着重要的生理功能，同时还具有多种生物学活性，因此研究真菌甾体类成分具有十分重要的理论意义和应用前景［4-5］。但是，作为真菌类的特征甾体，麦角甾醇在冬虫夏草研究中并没有得到足够重视。本文研究建立了冬虫夏草中的游离麦角甾醇的RP-HPLC-UV测定方法，取得了良好的效果，以期为评价该药材质量标准提供参考数据。

1 仪器与试药

Waters 2695-2489高效液相色谱仪（紫外检测器）；超声波清洗器；METTLER 105DU电子天平。

麦角甾醇对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111845-201102）；20批冬虫夏草样品为从青海和西藏收集，均由中国食品药品检定研究院张继副主任药师鉴定为正品。甲醇为色谱纯；水为Milipore。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。流动相：甲醇－水（98∶2）。检测波长：282nm。流速：1mL·min－1。柱温：30℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取麦角甾醇对照品约5 mg，精密称定，用甲醇溶解并定容至50mL，得对照品储备液。精密量取1mL该储备液，甲醇稀释并定容至10mL，得麦角甾醇对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末0.15 g于具塞锥形瓶中，精密加入10mL甲醇，称重，超声处理60 min，取出放置至室温，称重，用甲醇补重，过0.45μm滤膜，即得。

2.3 线性关系考察

分别精密量取麦角甾醇对照品储备液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，甲醇稀释并定容至25mL，摇匀。按上述色谱条件分别精密吸取稀释后的对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，测得峰面积积分值。以峰面积积分值为纵坐标，麦角甾醇对照品进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：Y＝2×106X＋2 427，r＝0.999 9，麦角甾醇的线性范围为0.042 72～0.427 2μg，该范围内麦角甾醇进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

取对照品溶液分别进样6次，每次20μL，测定麦角甾醇峰面积，并计算RSD＝1.18%，表明仪器精密度符合要求。

2.5 重复性试验

取1号样品（青海产）粉末按照供试品溶液制备方式平行制备6份供试品溶液，分别进样20μL，测定并计算。结果样品中麦角甾醇平均含量为0.095%（n＝6），RSD＝1.99%，说明重复性符合要求。

2.6 稳定性试验

取1号供试样品溶液分别于0，2，4，8，12，16，20，24 h进样，测定麦角甾醇峰面积值，计算RSD＝0.68%，表明供试品溶液中麦角甾醇24 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

取已知含量的1号样品粉末0.07 g共6份，分别加入浓度为10.64μg·mL－1的麦角甾醇对照品溶液5mL，依照上述供试品溶液制备方法及色谱条件制样、测定，并计算回收率见表1。

表1 麦角甾醇对照品回收率试验

2.8 样品的测定

取各批供试品溶液20μL，分别进样，记录峰面积，外标定量测得各批样品中麦角甾醇的含量，色谱图见图1。麦角甾醇的具体测定结果见表2。

图1 冬虫夏草中麦角甾醇含量测定HPLC图

表2 20批冬虫夏草中麦角甾醇的含量测定／%

3 讨论

分别考察了样品粉末在甲醇中超声20，40，60，80 min，发现超声60 min时麦角甾醇已提取完全，结合文献报道［4］，最终确定供试品溶液超声提取时间为60 min。

通过对麦角甾醇的对照品溶液200～400nm波长范围的扫描，发现282nm下的紫外吸收为最大，故选择该波长为检测波长。

由于麦角甾醇在C18色谱柱上保留行为较强，所以需要流动相中有机相的比例较大，笔者考察了甲醇－水和乙腈－水两种流动相系统，在色谱峰的峰形及保留时间上差别不大，考虑到检测成本，最终选用甲醇－水系统作为流动相。

利用本文建立的麦角甾醇测定方法，对20批冬虫夏草样品（青海产13批，西藏产7批）进行测定，结果表明麦角甾醇含量在0.013%～0.091%。其中青海产冬虫夏草麦角甾醇含量在0.013%～0.046%，西藏产冬虫夏草麦角甾醇含量在0.021%～0.091%。从本实验所测样品来看，西藏产虫草的麦角甾醇含量要高于青海产虫草，但是由于实验样品非常昂贵，收集有一定困难，所以收集样品量不大，以上结果还需扩大收集样品批数做进一步考察。

［1］石岩，王钢力，秦文杰，等.冬虫夏草化学成分综述［J］.中医研究，2006，19（7）：54-56.

［2］石岩，王钢力，林瑞超.近红外技术测定冬虫夏草中氨基酸含量［J］.药物分析杂志，2007，27（1）：90-92.

［3］赵余庆，于明，陈立君，等.冬虫夏草属真菌化学研究概况［J］.中草药，1999，30（12）：950-953.

［4］赵英永，赵晔，林瑞超，等.RP-HPLC法测定猪苓中麦角甾醇的含量［J］.药物分析杂志，2009，29（6）：898-900.

［5］李静，周立刚，文成敬.真菌甾体化合物的研究进展［J］.天然产物研究与开发，2008.20：165-171.

Study of Ergosterol in Cordyceps

SHIYan1，XIAO Xin-yue1，CHENG Xian-long1，WEIFeng1，ZHAO Ying-yong1，LIN Rui-chao1
（1.National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China；2.Biomedicine Key Laboratory of Shanxi Province，Northwest University，Xi′an 710069，China）

Objective：To establish a RP-HPLC method for quantitative analysis of ergosterol in Cordyceps.MethodsA Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5μm）column was used with the mobile phase beingmethanol-water（98∶2），flow rate being 1.0mL·min－1，detecting wavelength being 282nm.Results：The method had good linear relationship within the range of 0.042 72～0.427 2μg（r＝0.999 9）.The average recovery was 98.7%（n＝6），RSD＝4.5%.Conclusion：Themethod is sensitive，quick and accuracy.

Cordyceps；Determination；RP-HPLC；Quality control；Ergosterol

* ［通讯作者］肖新月，E-mail：xiaoxy＠nicpbp.org.cn

2012-06-05）