河北道地药材板蓝根HPLC指纹图谱研究

孟岩 范丽芳 张兰桐 贾聚坤 王巧

板蓝根(Radix isatidis)为我国传统中药材，始载于《神农本草经》。《中国药典》(2010版一部)规定为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort．)的干燥根，性寒味苦，具有清热解毒、凉血利咽之功效，用于温疫时毒，发热咽痛，温毒发斑、痄腮、烂喉丹痧、大头瘟疫、丹毒、痈肿等症［1］。主要化学成分为有机酸类、氨基酸、生物碱类化合物。《现代中医药大辞典》有记载:河北为板蓝根主要产区之一。本文对来自不同产地的20批板蓝根样品进行了水溶性和脂溶性的HPLC-UV指纹图谱分析，以10批河北产道地药材生成对照指纹图谱，并与不同产地的板蓝根药材指纹图谱进行相似度比较，以确定板蓝根药材的质量。该方法重复性和精密度良好，有助于板蓝根药材的标准化种植与道地药材的质量控制，同时为该药材的鉴别提供新的依据。

1 仪器与试药

Waters 1525高效液相色谱仪，Waters 2487紫外检测器，Empower工作站;SCQ-200超声波清洗器(100 W，25 kHz)(上海声谱超声波设备厂)。乙腈为色谱纯(迪马公司)，水为二次蒸馏水，其他溶剂均为分析纯。靛蓝对照品(批号:110716-200206)、靛玉红对照品(批号:717-200204)和板蓝根对照药材(批号:121177-200302)均由中国药品生物制品检定所提供。本研究收集了20批不同产地的板蓝根(Radix isatidis)样品(经生药学鉴定)，见表1。晾干，切成小段，置烘箱内，于40℃烘干8 h，取出，用粉碎机粉碎，过3号筛，置干燥器中，备用。

表1 板蓝根药材样品来源

2 方法与结果

2．1 溶液的制备

2．1．1 靛蓝对照品储备液:取靛蓝对照品适量，精密称定，至25 ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释制成1 ml中含0．10 mg的溶液，精密吸取1．0 ml，置10 ml量瓶中，加氯仿溶解并定容，即得。

2．1．2 靛玉红对照品储备液:取靛玉红对照品适量，精密称定，置25 ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释制成1 ml中含0．15 mg的溶液，精密吸取1．0 ml，置10 ml量瓶中，加氯仿溶解并定容，即得。

2．1．3 水溶性部分样品溶液:取药材粉末0．25 g，精密称定，置10 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，称定重量，超声提取20 min，取出，放冷，用水补足重量，摇匀，取上清液，用微孔滤膜(0．45 μm)滤过，即得。

2．1．4 脂溶性部分样品溶液:取药材粉末2．0 g，精密称定，置50 ml圆底烧瓶中，精密加入25 ml氯仿，称重。于70℃恒温回流5 h，取出，放冷，用氯仿补足重量，摇匀，滤过，滤液蒸干，定容至 1 ml，微孔滤膜(0．45 μm)滤过，即得。

2．2 水溶性部分指纹图谱的建立

2．2．1 色谱条件及系统适用性试验:色谱柱为DiamonsilTM C18 柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)(迪马公司);甲醇-水为流动相，洗脱程序见表2;检测波长为260 nm，柱温为30℃，进样量为20 μl，所有色谱峰均达到基线分离。且在45 min内检测完成，见图1。

表2 流动相梯度洗脱程序

图1 道地板蓝根药材水溶性部分指纹图谱及共有峰标识

2．2．2 稳定性试验 取3号板蓝根药材粉末，精密称定，按2．

1．3 项下制备供试品溶液，分别于 0，2，4，6，8，10，12，24 h 检测指纹图谱。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版软件计算相似度，结果均大于0．9;各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化，其RSD值分别为0．11% ～1．5%和0．17% ～2．3%，说明样品在24 h内稳定。

2．2．3 精密度试验:制备3号样品的供试品溶液1份，重复进样6次，记录指纹图谱，相似度均大于0．9;各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值的RSD值分别为0．09% ～1．8%和0．15% ～2．5%，说明精密度良好。

2．2．4 重复性试验:平行制备3号样品的供试品溶液6份，分别进样，记录指纹图谱，相似度均大于0．9;各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值的RSD值分别为0．17% ～2．1%和0．29% ～2．9%，说明重复性良好。

2．2．5 水溶性部分的指纹图谱:取河北产板蓝根药材(1～10号样品)，按2．1．3项下制备供试品溶液，分别进样，进行HPLC分析，得到道地板蓝根药材水溶性部分的指纹图谱及其10个共有峰，见图1;10批道地药材指纹图谱及生成的对照图谱(R)，见图2;计算其相似度，见表3。

2．2．6 不同产地药材水溶性部分的指纹图谱:取不同来源的板蓝根药材(11～20号样品)，按2．1．3项下制备供试品溶液，分别进样，进行HPLC分析，得到10批不同来源板蓝根药材的指纹图谱，见图3;并计算其与对照指纹图谱比较的相似度，见表3。

图2 10批道地药材水溶性部分指纹图谱及生成的共有模式(R)(S1～S10:样品1～10 R:对照指纹图谱)

图3 不同产地板蓝根药材水溶性部分指纹图谱(S1～S10:样品11～20 R:对照指纹图谱)

表3 板蓝根药材水溶性部分指纹图谱与对照指纹图谱比较的相似度

2．2．7 结果分析:由表3可知，所收集20批板蓝根药材，其水溶性部分的成分基本一致，只是各峰峰面积稍有不同。板蓝根有大叶和小叶之分，其中小叶板蓝根为市售常用品。结果显示，大叶板蓝根水溶性部分与小叶板蓝根组分相同，相似度较高，与小叶板蓝根没有区别。因此，初步认定在以水溶性部分为药用部位时，大叶板蓝根可与小叶板蓝根混用。同时，其他产地与河北产板蓝根药材成分也一致，相似度无显著性差异。因此，初步认定在以水溶性部分为药用部位时，其它产地板蓝根均可替代河北产板蓝根使用。建议板蓝根水溶性部分指纹图谱相似度在0．850～1．000可统一使用。

2．3 脂溶性部分指纹图谱的建立

2．3．1 色谱条件及系统适用性试验:色谱柱为 DiamonsilTM C18 柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);乙腈 － 0．05% 磷酸为流动相，洗脱程序见表4;检测波长为300 nm，柱温为30℃，进样量为20 μl。理论板数按靛蓝、靛玉红的色谱峰计算分别为8 300、12 000，分离度均大于1．5，且在115 min内检测完成。见图4。

表4 流动相梯度洗脱程序

图4 道地板蓝根药材脂溶性部分指纹图谱及共有峰标识(9:靛蓝;10:靛玉红)

2．3．2 稳定性试验:取1号板蓝根药材粉末，精密称定，按2．1．4 项下制备供试品溶液，分别于 0，2，4，6，8，10，12，24 h 检测指纹图谱。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版软件计算相似度，结果均大于0．9;各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化，其RSD分别为0．19% ～1．95%和0．31% ～2．37%，说明样品在24 h内稳定。

2．3．3 精密度试验:制备1号样品的供试品溶液1份，重复进样6次，记录指纹图谱，相似度均大于0．9;各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值的RSD值分别为0．25% ～1．99%和0．58% ～2．90%，说明精密度良好。

2．3．4 重复性试验:平行制备1号样品的供试品溶液6份，分别进样，记录指纹图谱，相似度均大于0．9;各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值的RSD值分别为0．22% ～2．11%和0．76% ～2．95%，说明重复性良好。

2．3．5 脂溶性部分的指纹图谱:取河北产板蓝根药材(1～10号样品)，按2．1．4项下制备供试品溶液，分别进样，进行HPLC分析，得到道地药材的指纹图谱及其14个共有峰，见图4;10批道地药材指纹图谱及生成的对照图谱(R)，见图5;计算其相似度，结果见表5。

2．3．6 不同产地药材脂溶性部分的指纹图谱:取不同来源的板蓝根药材(11～20号样品)，按2．1．4项下制备供试品溶液，分别进样，进行HPLC分析，得到10批不同来源板蓝根药材的指纹图谱，见图6;计算其与对照指纹图谱比较的相似度，结果见表5。

2．3．7 结果分析:板蓝根脂溶性成分比较复杂，本实验以峰面积较大的峰进行积分比较。10批河北产小叶板蓝根药材的化学成分基本一致，但各成分含量高低有一定差别，靛蓝、靛玉红含量普遍较高，相似度也较高。而其他产地板蓝根(包括河北武安大叶板蓝根)均有成分缺失现象，且靛蓝、靛玉红含量较低。因此，以板蓝根脂溶性为药用部位时，一定要固定产地。目前甘肃产板蓝根充斥着药材市场，由表7可知，其相似度也较高;据图6所示，甘肃板蓝根靛蓝靛玉红含量相对较高。因此初步认定板蓝根脂溶性部分为药用部位时，甘肃板蓝根可以代替河北产板蓝根使用，并建议板蓝根脂溶性部分指纹图谱相似度在0．850以上。

图5 10批道地药材脂溶性部分指纹图谱及生成的共有模式(R)(S1～S10:样品1～10 R:对照指纹图谱)

图6 不同产地板蓝根药材脂溶性部分指纹图谱(S1～S10:样品11～20 R:对照指纹图谱)

表5 板蓝根药材脂溶性部分指纹图谱与共有模式比较的相似度

3 讨论

本实验采用HPLC-UV法，对来自不同产地的20批板蓝根样品的水溶性部分和脂溶性部分分别进行了指纹图谱分析，利用相似度软件以10批道地板蓝根指纹图谱生成对照指纹图谱，并对不同产地间药材的差异进行了研究。建立了河北道地药材板蓝根水溶性部分和脂溶性部分的对照指纹图谱，有助于板蓝根药材的质量控制及规范化种植，同时为板蓝根的鉴别提供新的依据。

迄今为止，尚无公认能反应板蓝根内在质量的指标成分用于控制其药材及制剂的质量［2］。现行药典对板蓝根的品质评价和控制是以精氨酸为指标，既不是特异性成分(不能鉴别真伪)，也不是有效成分(不能体现疗效好坏)，因此无法评价板蓝根药材的品质。在这种情况下，通过多种活性成分进行综合评价而进行质量控制显得较为客观实际。因此，这种可实现多组分、多指标分析，能反映中药材及其提取物以及其成品中全面的、多层次整体信息的指纹图谱是实现板蓝根药材及其制剂质量控制的最佳方法。

现有文献对不同产地板蓝根的水溶性或乙酸乙酯提取物进行指纹图谱研究，考虑板蓝根的化学成分和药理活性，本实验对水溶性和氯仿提取物两部分进行了检测［3－5］。板蓝根的药理作用之一为抗病毒，综合现有的研究成果表明，与板蓝根抗病毒作用相关的成分主要集中在大极性部位，这与板蓝根临床应用多以水提物为主相符，也符合板蓝根的传统用药方式，本实验采用水提法对样品进行处理。同时有实验证明氯仿提取物为板蓝根抗内毒素活性最强部位，靛蓝、靛玉红是其主要活性成份，且靛玉红是治疗慢性粒细胞白血病的有效成份之一［6］。因此，经实验筛选采用氯仿回流对板蓝根药材进行提取，作为脂溶性部分的样品溶液。从研究结果可以看出，所收集板蓝根样品水溶性部分均无明显差异，但脂溶性部分则差异较大。因此，板蓝根单一做水溶性或脂溶性某一部分的指纹图谱均不能完全反应板蓝根的内在质量。中药不同有效部位的药理作用不同，可根据不同的临床应用对中药进行选择。如传统用药如水煎剂、水提醇沉入药、或进行极性较大部分的实验研究，则以上部分地区所产板蓝根均无明显差别，可统一用药。而以脂溶性部分用药或进行实验研究，则宜使用道地药材。

本研究水溶性部分比较了不同提取时间的提取效果，确定超声20 min，各色谱峰的响应值不再增加，且方法稳定，重现性好。脂溶性部分比较了回流、索氏提取、超声提取等不同提取方法的提取效果，并比较了酸水提取、氨水碱化后提取、氯仿直接提取的方法，同时还考察了不同提取时间的提取效果。结果表明，以氯仿为提取溶剂，回流5 h时，各色谱峰的响应值不再增加，且方法稳定，重现性好。波长选择为以HPLC-DAD分析，得到三维全波长紫外扫描图，根据图谱选择各成分紫外吸收均较强，分离度较好的波长进行检测。

1 国家药典委员会主编．中国药典(一部)．北京:中国医药科技出版社，2010．191．

2 雷黎明，潘清平．板蓝根化学、药理、质量及提取方法的研究进展．时珍国医国药，2007，18:2578．

3 马莉，孙琴，李友，等．HPLC法测定板蓝根药材及制剂中靛蓝和靛玉红含量．药物分析杂志，2010，30:1644．

4 赵艳玲，曹琳，王伽伯，等．板蓝根水提物的HPLC指纹图谱．中草药，2005，36:1819．

5 林文艳，莫建霞，于荣敏，等．板蓝根药材HPLC指纹图谱研究．中国现代应用药学杂志，2005，22:378．

6 刘云海，方建国，谢委．板蓝根抗内毒素机制研究．中国药科大学学报，2003，34:442．