苦参素对肝星状细胞胶原合成能力的影响

张建荣 刘志刚 李丽华

近年来关于苦参素的实验研究很多，大多是在抗病毒方面［1，2］。大量临床实践证实，苦参素可以阻止甚至逆转肝脏纤维化，但其作用机制及调节途径尚不明确。肝纤维化以肝脏细胞外基质(ECM)大量增生沉积为特征，是各种慢性肝病所共有的病理特点，肝星状细胞(HSC)是胶原合成和降解的关键细胞，苦参素可能是通过抑制HSC总胶原及Ⅰ型胶原的合成，从而产生抗肝脏纤维化作用的。

1 材料与方法

1．1 试剂及主要仪器 苦参素注射液为市售产品，由上海第一生化药业公司生产。BMPI-1640培养基为美国Gibeo公司产品;无支原体胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司;纤维连接蛋白(FN)由上海医科大学细胞室提取并纯化;3H-脯氨酸(3H-Pro)试剂盒购自中国原子能研究所;主要仪器有超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、LS6500液闪仪。

1．2 细胞系 HSC系CFSC由美国Greenwel教授建系并惠赠，其表型为活化的HSC。

1．3 方法

1．3．1 细胞培养:细胞置于含8%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、4 mmol/L 谷氨酰胺及1 mol/L HEPES 的BPMI1640培养液中，37℃、5%CO2条件下培养。每次实验均在呈指数生长的细胞中进行，将肝星状细胞以3×104/ml密度接种于2块96孔培养板，一块用于胶原合成的测定，另一块用于蛋白的提取，每孔100 μl，使其在24 h内达到近90%融合，换为不含血清的培养基使其同步化12 h，并分为:对照组、FN预刺激组(FN组)及苦参素干预组 (A、B、C、D、E、F组，苦参素浓度分别为 30、60、120、240、480、960 mg/L)，FN 组及苦参素干预组分别用60 μg/ml的 FN预刺激 HSC。用培养液倍比稀释100 μl苦参素至终浓度分别为 30、60、120、240、480、960 mg/L，分别加入到A、B、C、D、E、F 6个干预组中，每组设6个副孔。

1．3．2 3H-Pro掺入法检测总胶原及Ⅰ型胶原合成:将HSCs以1×105/孔的密度接种于24孔培养板并使其在24 h内达到近90%融合，换为不含血清的培养基使其同步化12 h，并按上述方法分组，6复孔/组。同步化后按照上述方法转染，同时加入3H-Pro至终浓度3 μCi/ml干预24 h。收集上清，每孔上清液等分为两份分别移入2 ml Eppendorf管:一管加Ⅰ型胶原酶0．5 mg/ml，另一管为空白对照，置37℃恒温作用3 h。3 h后每管加10%三氯醋酸500 μl沉淀胶原，并4℃，5 000 r/min，离心10 min去上清(去除游离3H-Pro)，并于每管加入2 ml闪烁液溶解沉淀物，置于闪烁杯，于液体闪烁记数仪上测定样品cpm值。细胞内胶原合成以Bq表示。按照下列公式计算:总胶原(Ⅰ型胶原合成量)(△cpm)=空白对照管cpm值－加入总胶原(Ⅰ型胶原合成量)后cpm值。

1．4统计学分析应用SPSS 13．0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，应用最小显著差异法(LSD)进行两两比较，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 苦参素对HSC总胶原合成的影响 经FN处理后，HSC总胶原合成在FN组显著高于对照组(P＜0．01)，而在苦参素干预HSC 48 h后HSC总胶原合成较FN组下降(P＜0．05)。见表1。

2．2 苦参素对HSCⅠ型胶原合成的影响 经FN处理后，HSCⅠ型胶原合成FN组显著高于对照组(P＜0．01)，而在苦参素干预HSC 48 h后HSCⅠ型胶原合成较FN组下降(P＜0．05)。见表1。

表1HSC总胶原及Ⅰ型胶原的合成±s

表1HSC总胶原及Ⅰ型胶原的合成±s

注:与对照组比较，*P ＜0．05，#P ＜0．01

型胶原合成对照组 476±52 186±32组别 总胶原合成 ⅠFN组 798±32# 438±26#A组 712±75* 409±44*B组 683±24* 366±35*C组 669±61* 351±52*D组 575±72* 287±61*E组 517±92* 208±32*F组 496±39* 191±25*

3 讨论

肝纤维化的实质是机体对慢性肝损伤所产生的愈合反应的失衡，表现为肝内ECM合成与分解的失衡，ECM的成分以Ⅰ型胶原为主。HSC是肝脏合成ECM的最主要细胞，因此，HSC活化并合成大量胶原是肝纤维化发生发展的中心环节。MMP13是对Ⅰ型胶原起降解作用的明胶酶，主要降解基底膜中胶原，肝脏纤维化时沉积的胶原含有大量的Ⅰ型胶原，推测它们也可以调控肝脏的胶原代谢［3］。近年来关于苦参素的实验研究很多，大多是在抗病毒方面。大量临床实践证实，苦参素还可阻止甚至逆转肝脏纤维化。既往一些研究表明，苦参素可抑制肝星状细胞的增殖［4］，从而产生抗纤维化作用，但其作用途径仍不明确。本研究发现苦参素能抑制肝星状细胞总胶原及Ⅰ型胶原的合成，由此可推测苦参素可能通过抑制肝脏总胶原和Ⅰ型胶原的合成，从而改善和逆转肝脏纤维化。

1 Xiaobin G，Quancheng K，Yifan S，et al．Effect of oxymatrine on interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha serum levels in an experimental rat model of autoimmune encephalomyelitis．Neural Regeneration Research，2010，5:3969．

2 张建春，胡娟．阿德福韦酯联合苦参素胶囊治疗慢性乙型肝炎临床研究．肝脏，2010，15:34-35．

3 Zhang M，Zhang JP，Ji HT，et al．Effect of six flavonoids on proliferation of hepatic stellate cells in vitro．Acta Pharmacol Sin，2000，21:253-256．

4 张汝建，卢兴梅，国力，等．苦参素对肝星状细胞增殖及凋亡的影响．泰山医学院学报，2009，30:23-24．