靶向乙酰肝素酶siRNA对大肠癌细胞恶性生物学行为的影响

张子华,吴海峰,杨锋荣,胡 浩,李恒建,白 霞

(江苏省吴江市中医医院普外科,江苏吴江,215221)

大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一,肿瘤转移是导致病死的主要原因,肿瘤浸润和转移是临床治疗失败的主要因素。随着对肿瘤侵袭转移机制的认识,发现有很多生物活性分子参与肿瘤的转移与浸润,其中主要包括乙酰肝素酶,该物质是一种内源性的葡萄糖酸酯酶,能够水解细胞表面、细胞外基质的乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的多糖侧链,促进肿瘤细胞侵人基质和血管壁[1],因此将乙酰肝素酶作为靶向治疗点成为研究的热点,国内外关于乙酰肝素酶的研究很多,但关于其与大肠癌的相关研究报道甚少,本文采用基因干扰的方法,研究乙酰肝素酶siRNA在大肠癌中作用,为大肠癌的临床治疗,特别是在基因治疗方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SW620细胞在37℃,5%CO2条件下传代培养。胰酶及噻唑蓝(MTF),佛波酯,二甲基亚砜(DMSO),Tr-answellTM培养板。IGO150CO2培养箱,Leica荧光倒置显微镜。SPF级裸小鼠20只购买自南京医科大学动物中心。Trizo总RNA提取试剂盒购自sigma公司。乙酰肝素酶siRNA购自日本 TaKaRa公司。定量实时 PCR引物购自日本Life Science公司。Hpa(H-80)兔抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司,即用型SP-9000检测试剂盒以及 DAB显色试剂盒均购自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 转染:选取对数期生长的大肠SW620癌细胞,胰酶消化法收集细胞,实验组(n=6)使用转染试剂将siRNA经逆转染法[2]导入大肠SW620癌细胞,将细胞悬浮液接种在24孔培养板中,21 h后待细胞融合70%左右时,用构建的乙酰肝素酶siRNA转染到大肠SW620癌细胞,48 h后用荧光显微检测其转染率。对照组的癌细胞(n=6)用非特异性的siRNA处理。

1.2.2 荧光显微镜检测细胞转染率:2组细胞在转染48 h后,在荧光显微镜观察其转染率。在200倍的显微镜下随机选取6个视野计算转染率。

1.2.3 PCR扩增:按照说明书,利用Trizo总RNA提取试剂盒对2组细胞进行总RNA提取,逆转录成模板cDNA,以该cDNA为模板对乙酰肝素酶基因进行实时定量PCR扩增。反应条件为:95℃预变性5 min,75℃,30s,复性。57℃,34 s,扩增,共40个循环。实验数据使用7500system软件进行统计分析。

1.2.4 乙酰肝素酶蛋白检测:采用细胞免疫组织化学染色的方法对两组细胞进行乙酰肝素酶蛋白的检测[3],细胞培养在24孔板中,待细胞出现贴壁,吸出培养基,用多聚甲醛固定癌细胞15 min,用PBS浸泡3次,每次5 min。采用免疫组织化学ABC法染色,加入过氧化物酶,封闭10 min,PBS浸泡3次,再分别加入一抗和二抗,洗脱,显色,显微镜下观察显色,加双蒸水终止反应。

1.2.5 细胞侵袭能力:采用24孔版凝胶侵袭小室检测,上下室间滤膜的孔径为10 μ m,可以模拟癌细胞的侵袭内环境。取实验组和对照组细胞各6 孔板 200 μL 加入上室,1000 μL 的培养液加入到下室,37℃,5%CO2条件下传代培养48 h后,4%多聚甲醛固定,染色,显微镜下随机6个视野观察下室内的细胞数。

2 结 果

2.1 转染率

分别用靶向乙酰肝素酶siRNA和非特异性的siRNA转染实验组和对照组,经显微镜下发现,2组的转染率无显著差异,见表1。

表1 2组的细胞的转染率()

表1 2组的细胞的转染率()

组别 n 转染细胞数(个) 转染率(%)实验组 6 103.5±11.3 62.8±6.3对照组 6 98.6±10.6 59.9±5.4

2.2 PCR检测乙酰肝素酶mRNA的表达

实验组的乙酰肝素酶mRNA的表达水平(0.3±0.1)显著低于对照组(2.3±1.5)(P<0.01)。

2.3 免疫组化检测乙酰肝素酶蛋白表达情况

结果显示实验组的乙酰肝素酶蛋白含量的表达水平(3.2±2.4)显著低于对照组(13.1±10.4)(P<0.05)。

2.4 细胞侵袭

通过侵袭实验检测细胞侵袭力,对照组的侵袭细胞数为(125.6±10.2)个显著多于实验组(21.3±5.8)个,差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

乙酰肝素酶于1975年被Ogren和Lindahl发现,经过几十年的深入研究,人们对其有了全面的了解,尤其是其与肿瘤浸润侵袭的关系引起科学工作者的广泛的关注,很多学者已经证实乙酰肝素酶是恶性肿瘤的重要的功能酶之一,乙酰肝素酶在卵巢癌组织的异常表达并参与卵巢癌细胞的生长、侵袭、转移和血管的生成[1]。乙酰肝素酶基因转染的方法也证实乙酰肝素酶在肿瘤侵袭转移中作用,提示乙酰肝素酶可作为治疗癌症转移的靶点。

有研究报道乙酰肝素酶在膀胱移行细胞癌组织中与膀胱移行细胞癌浸润、转移相关[4],在其他恶性肿瘤中亦有表达[5-6]。但在大肠癌研究中有关乙酰肝素酶的报道甚少,本课题研究对2组大肠癌细胞分别转染靶向的siRNA和非特异性的siRNA,发现其转染率无显著差异,推测是由于大肠癌细胞对于两种引物无显著的选择性,均可部分透过细胞膜达到转染的目的,与赵玲等[1]的研究报道一致。

另外通过RT-PCR检测乙酰肝素酶mRNA表达,并利用免疫组化检测乙酰肝素酶蛋白表达情况,发现实验组的乙酰肝素酶mRNA和蛋白含量均显著低于对照组,说明采用RNA干扰的方法,有效地抑制了乙酰肝素酶基因的转录和翻译,可能是由于siRNA能抑制乙酰肝素酶的细胞周期,逆转上皮细胞向间质细胞的转化。有研究发现[7]通过对胃癌细胞的乙酰肝素酶基因进行RNA干扰,可降低其mRNA及其蛋白含量,支持本研究结果。

本研究接着又做了侵袭实验来检测细胞侵袭力,结果显示实验组的细胞侵袭能力也显著低于对照组,我们推测可能是由于采用靶向乙酰肝素酶的siRNA能抑制或者降低乙酰肝素酶的水解多糖侧链功能,使其参与肿瘤细胞浸润转移的能力下降所致,研究发现应用抑制乙酰肝素酶药物后,肿瘤的浸润和转移能力都显著下降[8],刘玉设计构建的双基因shRNA基因真核表达载体,以脂质体介导的方法转染人卵巢癌细胞,可显著抑制卵巢癌细胞乙酰肝素酶基因和蛋白的表达。降低细胞侵袭能力[9]。应用乙酰肝素酶的反义核苷酸[10]与使用乙酰肝素酶抑制剂降低肿瘤细胞的转移能力相一致[11]。

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[4]陈芳,李丽.乙酰肝素酶、MM P-9在膀胱移行细胞癌侵袭转移中的表达相关性及临床意义[J].中国医药导报,2012,9(1):22.

[5]Fryer J F,Delwart E,Hecht F M,et al.Frequent detection of the parvoviruses,PARV4 and PARV5,in plasma from blood donors and symptomatic individuals[J].Transfusion.2007,47(6):1054.

[6]Heldt C L,Gurgel P V,Jaykus L A,et al.Identification of trimeric peptides that bind porcine parvovirus from mixtures containing human blood plasma[J].Biotechnol.Prog,2008,24(3):554.

[7]马秀梅,王栓柱,于宏,等.沉默乙酰肝素酶对人胃癌细胞侵袭迁移能力的影响[J].肿瘤,2009,29(10):924.

[8]王健.乙酰肝素酶在胆管癌组织中的表达及意义[D].中国医科大学,2010.

[9]刘玉,辛晓燕,毛敬,等.双基因shRNA干扰乙酰肝素酶在卵巢癌细胞中表达的实验研究[J].肿瘤,2006,26(11):984.

[10]Gao J,Su L,Qin R,et al.Transfection of antisense oligodeoxynucleotide inhibits heparanase gene expression and invasive ability of human pancreatic cancer cell in vitro[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2006,26(1):72.

[11]Zhao H,Liu H,Chen Y,et al.Oligomannurarate sulfate,a novel heparanase inhibitor simultaneously targeting basic fibroblast growth factor,combats tumor angiogenesis and metastasis[J].Cancer Res,2006,66(17):8779.