人多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞条件培养液诱导破骨前体细胞的分化成熟*

汤丽苑， 徐 钰， 陈 瑾， 刘新华， 俞 康△

(1温州医学院附属第一医院血液科, 2温州医学院，3温州医学院血液肿瘤与移植免疫研究所，浙江 温州 325000)

1000-4718(2012)04-0649-06

2011-08-26

2012-01-18

温州医学院5010重大项目子课题(No.XNK05005)

△通讯作者Tel:0577-88069517;E-mail：yukang62@126.com

人多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞条件培养液诱导破骨前体细胞的分化成熟*

汤丽苑1， 徐 钰2， 陈 瑾2， 刘新华3， 俞 康1△

(1温州医学院附属第一医院血液科,2温州医学院，3温州医学院血液肿瘤与移植免疫研究所，浙江 温州 325000)

目的探讨人多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞条件培养液对破骨前体细胞RAW264.7的影响。方法Western blotting检测可溶性核因子κB 受体激活剂配体(soluble receptor activator of NF-κB ligand, sRANKL)的蛋白表达。抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色观察RAW264.7细胞的分化成熟情况。RT-PCR法检测RAW264.7细胞TRAP和cathepsin K mRNA的表达。结果Western blotting法证实RPMI 8226细胞条件培养液中含有sRANKL。TRAP染色发现RPMI 8226细胞条件培养液能诱导RAW264.7细胞分化为TRAP阳性的多核成熟破骨细胞。人抑制性RANKL单克隆抗体拮抗30%RPMI 8226细胞条件培养液中sRANKL的作用，且具有剂量依赖性。30% RPMI 8226细胞条件培养液能刺激RAW264.7细胞上调TRAP和cathepsin K mRNA表达。结论人多发性骨髓瘤细胞RPMI 8226条件培养液中的sRANKL具有促RAW264.7破骨前体细胞分化成TRAP阳性的多核成熟破骨细胞的生物活性。人抑制性RANKL单克隆抗体阻断30%RPMI 8226细胞条件培养液中sRANKL的诱导分化作用，且具有浓度依赖性。

多发性骨髓瘤； 破骨细胞； 核因子κB受体激活剂配体

骨髓瘤骨病是多发性骨髓瘤的重要病理改变之一，是影响骨髓瘤患者生活质量和预后的重要因素。目前认为骨髓瘤骨病由骨重建失调所致，包括破骨功能增强和成骨功能减弱，新生骨质未能代偿性增加,引起骨质破坏[1]。核因子κB受体激活剂(receptor activator of NF-κB, RANK)/RANK配体(RANK ligand,RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)系统与骨髓瘤骨病发病机制密切相关[2]，其靶向治疗是目前研究的热点[3-4]。本文建立骨髓瘤细胞诱导破骨细胞分化的细胞模型，探讨人多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞表达sRANKL对RAW264.7细胞分化成熟的影响，同时研究人抑制性RANKL单克隆抗体在其中的抑制作用，为今后靶向治疗提供实验和理论基础。

材 料 和 方 法

1材料

人多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞由浙江大学医学院血液研究所金洁教授惠赠(ATCC，编号:CCL-155)。鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)购于北京协和医科大学细胞库(ATCC ，编号:TIB-71)。人成骨肉瘤细胞(MG-63) 购于武汉大学细胞保藏中心(CCTCC，编号:GDC074)。人抑制性RANKL单克隆抗体(RANKL mAb，型号：MAB6262)、人RANKL单克隆抗体MAB6263(用于Western blotting)和重组人RANKL蛋白(rhRANKL)购于R&D。TRAP染色试剂盒购于Sigma。Random Primer、逆转录酶、RNasin、dNTP、5×Reaction Buffer购于Fermentas。PCR 引物由上海生工生物工程公司合成。Platinum PCR SuperMix购于Invitrogen。Amicon Ultra-15超滤管(15 mL，10 kD)购于 Millipore。ECL发光试剂盒购于Pierce。

2方法

2.1工作液的配制 RANKL mAb干粉500 μg用1 mL无菌PBS溶解，配成浓度为500 mg/L，分装后-80 ℃储存。MAB6263干粉100 μg用200 μL无菌PBS溶解，配成浓度为500 mg/L，分装后-80 ℃储存。rhRANKL干粉10 μg用0.2 mL无菌PBS溶解，配成浓度为50 mg/L，加入0.1%人白蛋白保持其活性，分装后-80 ℃储存。

2.2细胞培养和条件培养液及其浓缩液的收集 RPMI 8226细胞、RAW264.7细胞与MG-63细胞用10% FCS-DMEM培养基培养,培养条件为37 ℃、5 % CO2，2～4 d换液传代。台盼蓝拒染实验检测活细胞率均在95%以上。RPMI 8226和MG-63细胞处于对数生长期时，以1×108/L密度传代接至25 cm2细胞培养瓶内，培养2 d后将细胞悬液或上清液移至离心管中，200×g离心5 min后，取上清液，500×g离心10 min完全去除细胞后，收集条件培养液，-80 ℃冻存备用。RPMI 8226细胞条件培养液15 mL加入超滤管中，离心机甩平转子4 000×g，30 min，取出浓缩液300 μL，称量离心前后离心管重量，评估浓缩50倍，分装后-80 ℃储存。

2.3Western blotting法检测 RPMI 8226细胞取对数生长期时传代，以1×108/L密度接种于25 cm2的培养瓶中，培养2 d后分别通过离心获取细胞，提取总蛋白。RPMI 8226细胞50×浓缩条件培养液和1×条件培养液经蛋白裂解后，将20 μL蛋白经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后，转移至PVDF膜，于摇床上封闭1.5 h，分别加入鼠抗人RANKL单克隆抗体(MAB6263)，4 ℃过夜，TBST充分漂洗。加入辣根过氧化物酶连接的羊抗鼠IgG室温轻摇1.5 h，同上漂洗，与ECL化学发光试剂反应，常规方法显色、定影。

2.4TRAP染色 根据试剂盒使用说明书的步骤进行。RAW264.7细胞以每孔1.5×104接种于6孔板，培养过夜后更换不同条件培养液(100 μg/L rhRANKL、30%MG-63细胞条件培养液、30%RPMI 8226细胞条件培养液以及0.00006 mg/L、0.0006 mg/L、0.006 mg/L、0.06 mg/L、0.6 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/L不同浓度RANKL mAb加入30%RPMI 8226细胞条件培养液组)，第7 d TRAP 染色，细胞用4%多聚甲醛固定10 min后，加染色液，37 ℃避光水浴90 min 后，双蒸水洗3 次,干燥后用中性树脂封固，光镜下(放大100倍)对各组每孔中TRAP阳性多核破骨细胞(≥3个核)进行计数,并摄片记录。

2.5RT-PCR检测 每培养孔加1.0 mL Trizol混匀，以一步法抽提总RNA，紫外分光光度法检测RNA浓度和纯度，计算各组A260/A280比值(> 1.8)。逆转录体系含RNA 1 μg，dNTP 2.0 μL，Oligo (dT)1 μL，M-MuLV逆转录酶1 μL，4×107U/L RNasin 0.25 μL，DEPC水补充至20 μL，42 ℃ 60 min，70 ℃10 min完成逆转录反应。PCR反应体系为Platinum PCR SuperMix 13 μL，cDNA 1 μL，引物1 μL。反应条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，退火温度30 s，72 ℃ 1 min，36个循环，72 ℃ 10 min。以β-actin为内参照，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，扫描条带后用Quantity One软件，以目的条带与内参照条带吸光度值之比作为目的基因mRNA相对含量，重复实验3次。各引物和退火温度见表1。

3统计学处理

表1RT-PCR引物及退火温度

Table 1. Primers and annealing temperatures for RT-PCR

GenePrimersequenceTm(℃)β-actin(602bp)5’-gccatcctgcgtctggacctg-3’5’-catttgcggtgcacgatggag-3’58CathepsinK(324bp)5’-gggccaggatgaaagttgta-3’5’-ccgagccaagagagcatatc-3’55TRAP(101bp)5’-caccctgagatttgtggctgt-3’5’-cggttctggcgatctctttg-3’60

结 果

1Westernblotting法检测sRANKL蛋白表达

RPMI 8226细胞表达跨膜型RANKL(mRANKL,43 kD)和 sRANKL (24 kD)。50×RPMI 8226细胞浓缩条件培养液发现sRANKL (24 kD)表达。但1×RPMI 8226细胞条件培养液未见表达，见图1。

Figure 1. The expression of sRANKL protein detected by Western blotting. Lane 1:1×RPMI 8226 cell conditioned medium; Lane 2:RPMI 8226 cells; Lane 3:50×RPMI 8226 cell conditioned medium.

图1Westernblotting检测sRANKL蛋白的表达

2TRAP染色观察RAW264.7细胞形态

TRAP染色观察无诱导空白组RAW264.7细胞胞体较小，大部分细胞呈TRAP阴性单核细胞，少数为TRAP阳性的单核或多核细胞。rhRANKL、RPMI 8226细胞条件培养液和MG-63细胞条件培养液诱导组成熟破骨细胞数量明显增多，胞体较大，形态不规则，呈油煎蛋形或漏斗形等，具有几个到几十个不等的细胞核(≥3个)，细胞边缘见伪足样突起，胞浆呈空泡状，胞浆TRAP活性部位呈玫瑰红色，细胞核为阴性，即为TRAP阳性多核成熟破骨细胞。加RANKL mAb组与无单抗组相比，TRAP阳性的多核细胞形态相似，但数量明显减少，见图2。

3TRAP阳性的多核破骨细胞计数

3.1100 μg/L rhRANKL、30% RPMI 8226细胞条件培养液与30% MG-63细胞条件培养液对RAW264.7细胞的诱导作用 3组条件培养液诱导的TRAP阳性多核破骨细胞数和空白组比较有显著差别，P<0.01。100 μg/L rhRANKL诱导组比其它两诱导组有明显差异(P<0.01)，见图3。

3.21 mg/L RANKL mAb抑制30% RPMI 8226细胞条件培养液与100 μg/L rhRANKL对RAW264.7细胞的诱导作用 1 mg/L RANKL mAb抑制30% RPMI 8226细胞条件培养液和100 μg/L rhRANKL诱导的TRAP阳性多核破骨细胞数明显低于不加抗体组(P<0.01)。1 mg/L RANKL mAb阻断30%RPMI 8226细胞条件培养液组与空白组无差别；而1 mg/L RANKL mAb阻断100 μg/L rhRANKL组相比空白组差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

Figure 2. The morphological changes of RAW264.7 cells(TRAP staining,×100). A：control；B：100 μg/L rhRANKL；C：30%RPMI 8226 cell conditioned medium；D：30%MG-63 cell conditioned medium；E：100 μg/L rhRANKL +1 mg/L RANKL mAb；F：30%RPMI 8226 cell conditioned medium +1 mg/L RANKL mAb；G：30%RPMI 8226 cell conditioned medium +0.6 mg/L RANKL mAb.

图2RAW264.7细胞株TRAP染色形态图

图3RPMI8226与MG-63细胞条件培养液、rhRANKL诱导RAW264.7细胞分化成熟的作用

3.3不同浓度RANKL mAb阻断30% RPMI 8226细胞条件培养液诱导RAW264.7细胞分化的作用 0.6、1、1.5 mg/L RANKL mAb抑制组显著抑制30% RPMI 8226细胞条件培养液诱导的破骨细胞分化成熟作用(P<0.01)。0.06 mg/L RANKL mAb抑制组也具有明显抑制作用(P<0.05)。0.00006、0.0006与0.006 mg/L RANKL mAb抑制组则阻断效果不明显(P>0.05)，见图5。

图41mg/LRANKLmAb抑制30%RPMI8226细胞条件培养液与100μg/LrhRANKL诱导RAW264.7细胞分化成熟的作用

图5RANKLmAb浓度依赖性阻断30%RPMI8226条件培养液诱导分化作用的量效关系

4RAW264.7细胞的TRAP与cathepsinKmRNA表达

4.1TRAP mRNA表达 30% MG-63细胞条件培养液组、30% RPMI 8226细胞条件培养液组、100 μg/L rhRANKL组和30% RPMI 8226细胞条件培养液+0.6 mg/L mAb组的TRAP mRNA相对表达量明显高于空白组，P<0.01。30% RPMI 8226细胞条件培养液+1 mg/L RANKL mAb组比其无抗体组TRAP表达量低(P<0.05)，见图6。

4.2Cathepsin K mRNA表达 30% RPMI 8226细胞条件培养液组、30% RPMI 8226细胞条件培养液+0.6 mg/L和1 mg/L RANKL mAb组、100 μg/L rhRANKL组、100 μg/L rhRANKL +1 mg/L RANKL mAb组和30% MG-63细胞条件培养液组与空白组相比，cathepsin K mRNA表达增高(P<0.05)。其余组间均无显著差异，见图7。

讨 论

多发性骨髓瘤起源于早期前B细胞恶性克隆，表现为骨质破坏、反复感染、高钙血症、贫血和肾功能不全等。骨髓瘤微环境中RANKL/OPG比例严重失衡，RANKL过度表达，OPG表达和活性降低，导致破骨细胞功能增强，骨损伤加重[5]。近年来，国内外学者针对RANKL/RANK/OPG系统进行靶向治疗研究，如 Reuter等[6]报道信筒子醌能通过抑制RANKL来阻止骨髓瘤诱导的破骨细胞分化成熟。王艺华等[7]报道马钱子碱能抑制骨髓瘤细胞对成骨细胞株RANKL的mRNA表达,上调碱性磷酸酶、骨钙蛋白及OPG的mRNA表达，证明马钱子碱对骨髓瘤的治疗效果优于硼替佐米。但至今仍未有公认的RANKL/RANK/OPG系统靶向药物应用于骨髓瘤。本实验为此建立细胞模型, 研究RANKL在人骨髓瘤细胞RPMI 8226条件培养液诱导RAW264.7细胞分化成熟影响中的作用,并且为今后靶向治疗奠定实验基础。

图6各组TRAPmRNA表达

图7各组诱导cathepsinKmRNA表达

本实验采用单克隆抗体免疫沉淀法证实RPMI 8226细胞表达RANKL蛋白(包括mRANKL和sRANKL)，但检测不到1×108/L RPMI 8226细胞条件培养液sRANKL蛋白表达，再将细胞培养液经超滤管浓缩50倍后可检测到sRANKL蛋白。同时以MG-63细胞[8]条件培养液与rhRANKL为阳性对照，发现RPMI 8226细胞能明显诱导RAW264.7细胞分化为TRAP阳性的多核破骨细胞。这与Lai等[9]报道的人骨髓瘤细胞NCI-H929和U266的条件培养液能诱导人骨髓单个核细胞分化为TRAP阳性的多核破骨细胞一致。同时1 mg/L人抑制性RANKL单克隆抗体能显著阻断30%RPMI 8226细胞条件培养液与100 μg/L rhRANKL诱导的RAW264.7细胞分化成熟作用，证明RPMI 8226细胞条件培养液中起诱导破骨细胞分化作用的重要成分为sRANKL。

高浓度抑制性RANKL单克隆抗体(0.6、1、1.5 mg/L)能显著抑制30%RPMI 8226细胞条件培养液诱导破骨前体细胞分化成熟作用。中等浓度RANKL抗体(0.06 mg/L)也具抑制作用(P<0.05)。低浓度RANKL抗体(0.00006、0.0006、0.006 mg/L)抑制效果不明显。说明人抑制性RANKL单克隆抗体阻断30%RPMI 8226细胞条件培养液中sRANKL诱导的破骨细胞分化成熟作用具有剂量依赖性。

本实验RT-PCR法显示RAW264.7细胞未受诱导时就表达破骨细胞表型基因TRAP与骨吸收功能相关基因cathepsin K。30% RPMI 8226细胞条件培养液能刺激RAW264.7细胞上调TRAP和cathepsin K mRNA表达，与rhRANKL和MG-63细胞对照组相似。1 mg/L 人抑制性RANKL单克隆抗体抑制30% RPMI 8226细胞条件培养液组TRAP mRNA表达低于无抗体组，这与TRAP染色实验中该干预组诱导TRAP阳性破骨细胞减少的结果一致。但cathepsin K mRNA受人抑制性RANKL单克隆抗体抑制作用不明显。

本实验证实了多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞条件培养液中所含的sRANKL具有促使RAW264.7细胞分化成TRAP阳性多核成熟破骨细胞的生物活性，且人抑制性RANKL单克隆抗体阻断30%RPMI 8226细胞条件培养液中sRANKL的诱导分化作用具有浓度依赖性。这一发现将为探索多发性骨髓瘤骨病的分子机理以及寻找治疗新靶点提供理论依据和实验基础，为广大骨髓瘤患者造福。

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EffectofconditionedmediumofhumanmultiplemyelomaRPMI8226cellsonosteoclastogenesisofRAW264.7cells

TANG Li-yuan1, XU Yu2, CHEN Jin2, LIU Xin-hua3, YU Kang1

(1DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege;2WenzhouMedicalCollege,3HematologicMalignanciesandTransplantationImmunityResearchCenterofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:yukang62@126.com)

AIM: To investigate the osteoclastogenic effect of conditioned medium of human multiple myeloma RPMI 8226 cells on preosteoclast RAW264.7 cells.METHODSThe protein expression of soluble receptor activator of NF-κB ligand (sRANKL) was detected by Western blotting. The morphological changes of RAW264.7 cells were observed after tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining. The mRNA expression of TRAP and cathepsin K was evaluated by RT-PCR.RESULTSThe result of Western blotting showed that conditioned medium of RPMI 8226 cells contained sRANKL. RPMI 8226 cell conditioned medium induced RAW264.7 cells to differentiate into TRAP-positive multinuclear osteoclasts. Human neutralized RANKL monoclonal antibody suppressed the differentiation of preosteoclasts in a dose-dependent manner, which was induced by 30% RPMI 8226 cell conditioned medium. RPMI 8226 cell conditioned medium increased the mRNA expression of TRAP and cathepsin K in RAW264.7 cells.CONCLUSIONThe sRANKL in conditioned medium of human multiple myeloma RPMI 8226 cells has the bioactivity to induce preosteoclast RAW264.7 cells to differentiate into TRAP-positive multinuclear osteoclasts. Human neutralized RANKL monoclonal antibody suppresses the differentiation of preosteoclasts induced by sRANKL in a dose-dependent manner.

Multiple myeloma; Osteoclast; Receptor activator of NF-κB ligand

R733.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.013