趋化因子CXCL11在急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺组织的表达及其作用

张海峰 吴兴 丁晓凌 强晖 曹维 陈海琴 周国雄

·论著·

趋化因子CXCL11在急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺组织的表达及其作用

张海峰 吴兴 丁晓凌 强晖 曹维 陈海琴 周国雄

目的观察趋化因子CXCL11在急性坏死性胰腺炎(ANP)病程中的动态变化，探讨其在ANP发病过程中的作用。方法48只SD大鼠按数字表法随机分为对照组和ANP组，每组24只。采用4%牛黄胆酸钠(1 ml/kg体重)逆行胰胆管注射方法制备ANP大鼠模型。术后1、3、6、12 h处死大鼠，留取标本。检测血清淀粉酶活性，胰腺组织行常规病理检查并评分，免疫组化法检测胰腺组织CXCL11表达，定量PCR法检测胰腺组织CXCL11 mRNA 表达，酶联免疫吸附试验法检测血清CXCL11水平。结果ANP组大鼠血清淀粉酶活性较对照组显著升高[6 h时为(6153±355)U/L比(185±32)U/L，P<0.05]；胰腺病理损伤明显，病理评分较对照组显著增加[6 h时为(9.00±0.63)分比(0.33±0.12)分，P<0.05]；胰腺组织CXCL11 mRNA及蛋白表达较对照组显著增强(6 h时为3.13±0.43比0.99±0.24，2.76±0.27比0.33±0.12，P值均<0.05)；血清CXCL11水平较对照组明显升高[6 h时为(112.1±14.2)ng/L比(56.8±4.3)ng/L，P<0.05]。结论CXCL11是急性胰腺炎早期的炎症介质，参与了大鼠ANP的发病过程。

胰腺炎，急性坏死性； 趋化因子类； CXCL11

趋化因子CXCL11又称I-TAC,全称为干扰素诱导T细胞α趋化因子，由神经胶质细胞、支气管内皮细胞、血管内皮细胞等细胞分泌。其受体CXCR3主要在Th1细胞表达，在炎症局部发挥诱导炎性细胞聚集的作用。有研究表明，在慢性胰腺炎中CXCL11及CXCR3表达明显增加，但在重症急性胰腺炎中CXCL11是否参与尚不清楚。本实验检测急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺及血清CXCL11的表达，探讨其在ANP发病过程中的作用机制。

材料与方法

一、动物模型的建立及实验分组

健康SD大鼠，清洁级，雌雄不限，体重(220±20)g，由南通大学实验动物中心提供。按数字表法将大鼠随机分成ANP组及对照组，每组24只。参照Lankisch等[1]方法，以0.1 ml/min的速度向胆胰管内注射4%牛磺胆酸钠1ml/kg体重制备ANP模型。对照组仅翻动胰腺2次后关腹。术后1、3、6、12 h分批抽血处死大鼠。

二 、检测指标与方法

1．淀粉酶测定：采用碘-淀粉比色法，由深圳迈瑞半自动生化分析仪测定，按照试剂盒说明书操作。

2．胰腺病理学检查：胰腺组织经HE染色后，由两位专业的病理医师双盲阅片。每组每个时间点取3张切片，每张切片选取10个高倍镜视野，参考Rongione等的评分标准，从水肿、感染、出血和坏死4方面进行评分(表1)，取各项积分和为最终得分。

表1 胰腺组织病理评分标准

3．胰腺组织CXCL11蛋白检测：采用常规免疫组织化学方法检测。兔抗鼠CXCL11抗体购自上海劲马生物公司，工作浓度1∶100。以公司提供的阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。用彩色病理图像分析系统采集图像。由两位病理医师双盲阅片。细胞质、核膜或胞膜呈现棕黄色颗粒为阳性。每张切片随机观察10个不同视野，计数阳性细胞，计算其占总细胞的百分比。

4．CXCL11 mRNA检测：采用定量PCR法。应用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取胰腺组织总RNA，根据Genbank中基因序列自行设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成。CXCL11引物序列为5′-GGCTGACAAAGTTGAAGTGA-3′和5′-CCA-AGACAGGAGAGGGTCAG-3′，产物191 bp；内参GAPDH引物序列为5′-AAGGTGGTGAAGCAGGCGGC-3′和5′-GAGCAATGCCAGCCCCAGCA-3′，产物130 bp。PCR反应参数：95℃ 15 min，95℃ 15 s、57℃ 30 s、72℃ 40 s，40次循环，72℃ 5 min。PCR产物经凝胶电泳分离后用图像扫描仪测定光吸收值，以目的条带与GAPDH条带的光吸收值比为mRNA相对表达量。

5．血清CXCL11水平检测：采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测，试剂盒购自上海劲马生物公司，严格按说明书操作。

三、统计学处理

结 果

一、血淀粉酶变化

术后1、3、6、12 h对照组大鼠血淀粉酶活性分别为(182±65)、(228±57)、(185±32)、(173±51)U/L，ANP组分别为(2914±503)、(3307±745)、(6153±355)、(7695±105)U/L，ANP组显著高于同时间点对照组(P值均<0.05)。

二、胰腺组织学改变及病理评分

对照组大鼠肉眼见胰腺、胰周脂肪组织、网膜均无异常，无腹水；镜下见细胞结构清楚，小叶结构明确，间质无水肿，无坏死、出血。ANP组6 h后肉眼可见大量血性腹水，胰腺水肿、出血、坏死，胰周及网膜可见皂化斑，与周围组织粘连；术后1、3 h镜下见小叶间质水肿，点状出血，炎性细胞浸润，部分腺泡细胞变性坏死，6、12 h见大量炎性细胞浸润，片状出血，小叶结构破坏，腺泡细胞大量坏死(图1)。术后1、3、6、12 h对照组胰腺的病理评分分别为(0.26±0.08)、(0.27±0.09)、(0.33±0.12)、(0.50±0.15)分，ANP组为(5.17±0.75)、(6.67±0.52)、(9.00±0.63)、(11.33±0.84)分，ANP组显著高于同时间点对照组(P值均<0.05)。

图1对照组(a)、ANP组(b)大鼠胰腺组织病理改变(HE ×200)

三、胰腺组织CXCL11蛋白表达

对照组大鼠胰腺腺泡细胞弱表达CXCL11蛋白，术后1、3、6、12 h的表达量分别为0.32±0.08、0.27±0.09、0.33±0.12、0.40±0.15，无显著变化；ANP组大鼠胰腺腺泡细胞CXCL11蛋白表达量明显增加(图2)，术后1、3、6、12 h的表达量分别为1.28±0.18、1.88±0.22、2.76±0.27、3.89±0.32，随时间延长而增加，且均显著高于同时间点对照组(P值均<0.05)。

图2对照组(a)、ANP组(b)大鼠胰腺组织CXCL11蛋白表达(免疫组化 ×400)

四、胰腺组织CXCL11 mRNA表达

术后1、3、6、12 h对照组大鼠胰腺组织CXCL11 mRNA表达量分别为1.12±0.22、1.01±0.15、0.99±0.24、1.01±0.32，无明显变化；ANP组大鼠表达量分别为1.31±0.22、2.10±0.34、3.13±0.43、2.81±0.37，随时间延长而逐渐升高，且较同时间点对照组显著增加(P值均<0.05，图3)。

图3胰腺组织CXCL11 mRNA的PCR扩增曲线(a)和熔解曲线(b)

五、血清CXCL11水平

术后1、3、6、12 h对照组大鼠血清CXCL11水平分别为(60.3±4.5)、(53.0±7.8)、(56.8±4.3)、(57.2±9.0)ng/L，ANP组分别为(82.2±11.3)、(94.0±9.9)、(112.1±14.2)、(102.5±13.1)ng/L，ANP组较同时间点对照组显著升高(P值均<0.05)。

讨 论

重症急性胰腺炎(SAP)患者病死有二个高峰[2-4]。第一个是在病程第1周，由于胰酶的激活、胰腺的自身消化及胰酶释放入血激活巨噬细胞等炎症细胞释放大量炎症因子(包括各种细胞因子)，触发炎症介质瀑布样级联反应[5-7]，通过血液循环和淋巴管途径，输送到全身，引起全身炎症反应综合征，导致多脏器功能障碍，微循环衰竭而病死；第二个是在发病后2～6周，多由于感染和菌血症、脓毒血症引起。

越来越多的研究表明，CXC和CC类趋化因子在轻症急性胰腺炎(MAP)向SAP演变及SAP的局部和全身并发症中起了重要作用 。应用趋化因子阻断剂可明显降低SAP的严重程度，减少SAP并发症，并提高疗效[8-14]。Brady等[9]以雨蛙肽和牛磺胆酸钠分别诱导大鼠水肿型和坏死型急性胰腺炎模型，结果显示胰腺组织MCP-1 mRNA表达增强，并且其表达强度与胰腺炎的轻重程度呈正比。Bhatia等[8]报道，用BX471拮抗CCR1促中性粒细胞的归巢，可减轻胰腺炎病情；拮抗CXCR2可减轻胰腺炎及其肺损伤程度。

CXCL11是非ELR类趋化因子，主要表达在正常个体胸腺、脾、肺、胰腺等器官的星形胶质细胞、支气管内皮细胞、血管内皮细胞等[7]，在生理情况下表达量较少。有资料表明，CXCL11-CXCR3系统的细胞趋化作用是免疫炎症反应的一个重要环节[15-16]，参与在炎症、感染、肿瘤、应激、自身免疫、变态反应、移植排斥反应、AIDS、淋巴细胞归巢以及新生血管形成等众多病理生理的发生发展过程[17-18]。在炎症、感染等条件下，IFN刺激血管内皮细胞等产生CXCL11，后者刺激活化的T细胞迁移，同时产生IFN等细胞因子，形成正反馈回路。

本研究结果显示，对照组胰腺CXCL11 mRNA及蛋白表达很弱，血清CXCL11水平很低。ANP组大鼠胰腺CXCL11 mRNA及蛋白表达明显增强，且与胰腺的病理损伤呈正比，血清CXCL11水平也升高，证实CXCL11是急性胰腺炎早期的炎症介质，检测血清CXCL11水平的动态变化或许可以帮助判断急性胰腺炎的病变程度。

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ExpressionandroleofchemokineCXCL11inpancreasofratswithacutenecrotizingpancreatitis

ZHANGHai-feng,WUXing,DINGXiao-ling,QIANGHui,CAOWei,CHENHai-qin,ZHOUGuo-xiong.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,China

ZHOUGuo-xiong,Email：zhouguoxiong@medmail．corn．cn

ObjectiveTo investigate the dynamic expressions of CXCL11 and its role in the pathogenesis of acute necrotizing pancreatitis (ANP).MethodsForty-eight SD rats were randomly divided into control group and ANP group, with 24 rats in each group. ANP model was induced by retrograde injection of 4% sodium taurocholate (1 ml/kg body weight) into the biliary and pancreatic duct. The rats were sacrificed at 1, 3, 6, 12 hours. Serum level of amylase was determined, pathological changes in pancreatic tissue were routinely observed and scored. The expression of CXCL11 mRNA and proteon in pancreas was measured by fluorescence quantitative polymerase chain reaction and immunohistochemical method. The serum levels of CXCL11 were measured by enzyme-linked immunoadsorbent assay.ResultsThe serum levels of amylase in ANP rats were significantly higher than those in control group [(6153±355)U/Lvs(185±32)U/L at 6 h,P<0.05], pathological changes in pancreatre tisues were more significant in ANP rats, and the pathological score was significantly higher than that in control group [(9.00±0.63)vs(0.33±0.12) points at 6 h,P<0.05]; the expressions of CXCL11 mRNA and protein in pancreatic tissue were significantly increased than those in control group (3.13±0.43vs0.99±0.24, 2.76±0.27vs0.33±0.12 at 6 h,P<0.05). The serum level of CXCL11 was significantly higher than that in control group [(112.1±14.2)ng/Lvs(56.8±4.3)ng/L at 6 h,P<0.05)].ConclusionsCXCL11 is an early inflammatory mediator in acute pancreatitis, and involved in the pathogenesis of ANP in rats.

Pancreatitis, acute ncerotizing； Chemokines, CXC; CXCL11

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.06.009

南通市社会发展基金(S5054)

226001 江苏南通，南通大学附属医院消化科(张海峰、丁晓凌、强晖、曹维、陈海琴、周国雄)；江苏省泗洪县人民医院消化科(吴兴)

周国雄，Email: zhouguoxiong@medmail.com.cn

2012-04-28)

(本文编辑：吕芳萍)