抑制KAI1诱导的自噬对胰腺癌MiaPaCa-2细胞增殖及凋亡的影响

吴春燕 郭晓钟 王华

抑制KAI1诱导的自噬对胰腺癌MiaPaCa-2细胞增殖及凋亡的影响

吴春燕 郭晓钟 王华

细胞自噬是一种重要的促细胞生存途径，同时也是一种不同于凋亡和坏死的死亡方式。KAI1是缺氧目的基因，体内缺氧时亦可诱导细胞自噬[1]。我们前期报道了KAI1诱导MiaPaCa-2自噬，并增加细胞的存活[2]，本研究进一步探讨抑制KAI1诱导的自噬对该细胞增殖及凋亡的影响。

一、材料与方法

1．CCK-8检测细胞增殖：应用KAI1抑制剂3-MA预处理MiaPaCa-2细胞1 h，以未处理组作为对照，应用100 MOI的Ad5-KAI1及Ad5-null分别感染细胞，具体步骤参考我们前期报道[3]。取转染细胞接种96孔板，培养0.5、1、2、3、4、5 d后每孔分别加入10 μl的CCK-8(Dojindo Molecular Technologies公司,日本)继续培养1 h，在酶标仪(Thermo, Germany)测定450 nm吸光值(A450)。每组设3个复孔，实验重复3次，取均值。

2．流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡：取上述各组不同时间点细胞，经洗涤后重悬于缓冲液中，每管加入8 μl Annexin V-FITC(北京众康志恒生物科技有限公司)，混合后加入5 μl PI，混均，避光孵育1 min，1 h内上流式细胞仪(eBioscience Dickinson)检测细胞的凋亡率，实验重复3次。

二、结果

1．3-MA预处理对KAI1诱导的MiaPaCa-2细胞自噬相关蛋白Beclin1表达的影响：感染Ad5-null的MiaPaCa-2细胞，不管是否用3-MA预处理，均对细胞Beclin1表达无显著影响。感染Ad5-KAI1细胞的Beclin1表达较感染Ad5-null细胞明显增加(P<0.05)，感染前用3-MA预处理的细胞的Beclin1表达水平增加明显受到抑制(P<0.05，图1)。

2．MiaPaCa-2细胞增殖的变化：感染Ad5-null的MiaPaCa-2细胞，不管是否用3-MA预处理，均对细胞的增殖无明显影响。感染Ad5-KAI1 48 h后，MiaPaCa-2细胞的增殖下降达29%(P<0.001)，感染前用3-MA预处理的细胞增殖下降幅度更大，达70%(P<0.001)。

3．MiaPaCa-2细胞凋亡的变化：感染Ad5-null的MiaPaCa-2细胞，不管是否用3-MA预处理的，均对细胞的凋亡无明显影响(图2)。感染Ad5-KAI1后6 h时细胞无明显凋亡，12 h时凋亡明显增加(P<0.001)，24 h时平均约60%的细胞发生凋亡，感染前用3-MA预处理的，细胞凋亡增加到约80%(P<0.001，图2)。

图1 各组细胞的Beclin1蛋白表达

图2 各组细胞的凋亡图(流式细胞仪)

讨论自噬在肿瘤发生、发展中的作用可能存在双重关系。一方面自噬可减少肿瘤坏死和炎症反应，减轻代谢过程中的基因损伤，维持细胞自我稳态，促进细胞生存；另一方面过度上调的自噬可以引起肿瘤细胞死亡，即“自噬性细胞死亡”，也称之为Ⅱ型程序化细胞死亡[4-5]。前期的研究发现，KAI1通过抑制胰腺癌细胞运动和迁移来抑制癌细胞转移[6-8]。KAI1亦可诱导人胰腺癌MiaPaCa-2细胞发生凋亡和自噬[2]。但尚不清楚这种由KAI1诱导的自噬对胰腺癌细胞增殖的影响。本实验应用自噬阻断剂3-MA预处理细胞，阻断其自噬的发生，之后再感染Ad5-KAI1，使细胞表达KAI1。结果发现，阻断自噬可显著增加KAI1诱导的肿瘤细胞凋亡，抑制胰腺癌细胞的生存，提示KAI1诱导的自噬的主要作用可能是通过负反馈调节，拮抗MiaPaCa-2细胞的凋亡，促进其生存，即KAI1诱导的自噬从本质上讲可能是胰腺癌肿瘤细胞的一种生存机制。Zhang等[9]研究发现，缺氧可通过诱导线粒体的自噬来保护细胞产生过多的氧反应物质和细胞死亡。本结果与其一致，即自噬可以保护细胞，促进细胞生存。我们前期研究已经发现，单纯应用KAI1治疗肿瘤疗效不甚理想，而KAI1诱导的自噬可能是导致KAI1对成瘤性影响甚微的原因，即体内KAI1对肿瘤细胞生长的这种抑制作用被KAI1和缺氧诱导的高水平自噬给部分抑制了。提示联合应用自噬抑制剂和KAI1可能在胰腺癌的药物治疗中具有广阔的应用前景。

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[3] Wu CY, Yan J, Yang YF, et al. Overexpression of KAI1 induces autophagy and increases MiaPaCa-2 cell survival through the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases. Biochem Biophys Res Commun,2011,404:802-808.

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[8] Guo XZ, Xu JH, Liu MP, et al. KAI1 inhibits anchorage-dependent and -independent pancreatic cancer cell growth. Oncol Rep,2005,14:59-63.

[9] Zhang H, Bosch-Marce M, Shimoda LA, et al. Mitochondrial autophagy is an HIF-1-dependent adaptive metabolic response to hypoxia. J Biol Chem,2008,283:10892-10893.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.021

国家自然科学基金(81071982、30470798)

110015 沈阳，沈阳军区总医院消化内科(吴春燕、郭晓钟)；军事医学科学院放射与辐射医学研究所(王华)

郭晓钟，Email:Guoxiaozhong1962@163.com

2011-05-28)

(本文编辑：屠振兴)