Infliximab对急性坏死性胰腺炎大鼠肠道屏障损害的保护作用

欧娅 贾林 邱嘉华 李伟冬 黄耀星 聂玉强

·论著·

Infliximab对急性坏死性胰腺炎大鼠肠道屏障损害的保护作用

欧娅 贾林 邱嘉华 李伟冬 黄耀星 聂玉强

目的探讨infliximab(TNF-α单抗)对大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)并多器官功能障碍综合征(MODS)模型肠动力及肠屏障损害的保护作用。方法30只SD大鼠按完全随机法分为假手术组、ANP组和infliximab组。经胰胆管逆行注射4.5%牛磺胆酸钠制备大鼠ANP并MODS模型，infliximab组于建模后6 h经尾静脉给予infliximab 8 mg/kg体重，对照组胰胆管逆行注射等量生理盐水。24 h后处死大鼠，检测血淀粉酶、TNF-α水平及二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸含量；胰腺及小肠组织常规病理检查及评分；碳素墨水法测小肠推进率。结果对照组、ANP组、infliximab组血清淀粉酶水平分别为(1125±331)、(11024±2203)、(545±30)U/L；TNF-α水平为(12.1±4.0)、(107.6±18.5)、(75.8±5.9)U/L；胰腺病理评分为(2.25±0.38)、(14.1±0.22)、(3.93±0.67)分；小肠病理评分为(2.29±0.32)、(6.61±0.58)、(3.91±0.41)分；血清DAO含量为(87.88±34.51)、(146.30±12.99)、(115.00±18.58) μg/L；D-乳酸含量为(1.50±0.49)、(2.32±0.35)、(2.02±0.25) mmol/L；小肠推进率为(0.64±0.04)%、(0.28±0.08)%、(0.52±0.09)%，各组间比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论早期使用infliximab可有效改善ANP大鼠的胃肠动力功能及减轻肠屏障损害。

胰腺炎，急性坏死性； 肿瘤坏死因子； 单克隆抗体； Infliximab； 肠道屏障

重症急性胰腺炎(SAP)发病机制中，TNF-α是一系列瀑布样级联炎症反应的始动和促进因子，可导致肠屏障功能障碍，促使细菌和内毒素易位，最终导致多器官功能障碍综合征(MODS)的发生。文献报道[1-2]，实验性急性坏死性胰腺炎(ANP)建模后6 h为抗炎症介质治疗窗。为此，本实验用TNF-α单抗infliximab干预ANP大鼠，观察其对ANP并MODS大鼠肠道屏障损害的保护作用。

材料与方法

一、实验动物及分组

雌性SD大鼠30只，体重190～220 g，SPF级，由广州中医药大学实验动物中心提供。按完全随机法分成假手术组、ANP组和infliximab组。实验前大鼠禁食12 h，不禁水。采用4.5%牛磺胆酸钠(Sigma公司)胰管内逆行注射的方法制备大鼠ANP并MODS模型[3]。假手术组向胰管内逆行注射等量生理盐水。infliximab组大鼠于建模后6 h经尾静脉注射8 mg/kg体重的infliximab(西安杨森公司)。建模后23.5 h经灌胃针给予碳素墨水灌胃，每只2.5 ml，30 min后处死大鼠并解剖，留取胰腺、小肠标本；腹腔静脉采血，离心取血清，置-80℃冰箱保存。

二、检测指标及方法

1．血清淀粉酶、TNF-α、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸水平检测：采用酶联耦合法测定血淀粉酶。ELISA法检测血清TNF-α、DAO水平，试剂盒分别购自美津生物公司及R&D公司。采用改良分光光度法测定血清D-乳酸水平，试剂盒购自博世生物公司。

2．小肠推进率测定：将留取的肠管展于白纸上，以幽门为基点，无张力状态下量取幽门括约肌至色素最前端及至盲肠的距离，以两者百分比为小肠推进率，评价肠道动力。

3．组织学检查：留取的大鼠胰腺及小肠组织常规行病理学检查，由专一病理医师阅片，并按照schemidt标准进行胰腺组织病理评分[4]，按照Chiu′s分级进行小肠组织病理评分[5]。

三、统计学处理

结 果

一、一般情况

假手术组大鼠一般情况良好，无死亡。ANP组大鼠出现呼吸急促、腹胀、竖毛、精神萎靡、反应迟钝、无大便排出等表现，造模24 h内死亡3只。infliximab组大鼠一般情况较好，多数排稀便，造模24 h内死亡2只。

二、血清淀粉酶、TNF-α水平与胰腺病理改变

造模24 h后，假手术组、ANP组与infliximab组大鼠血清淀粉酶水平分别为(1125±331)、(11024±2204)、(545±30)U/L，各组比较差异均有统计学意义(F=21.76、21.49、24.36，P<0.05)；TNF-α水平分别为(12.1±4.0)、(107.6±18.5)、(75.8±5.9)U/L，各组比较差异也均有统计学意义(F=19.2、4.55、13.45，P<0.05)。假手术组胰腺轻度间质水肿，腺泡局部炎细胞浸润；ANP组胰腺广泛间质水肿，成堆腺泡坏死，大量出血及炎细胞浸润；infliximab组胰腺损伤较ANP组有不同程度的减轻。假手术组、ANP组与infliximab组胰腺病理评分分别为(2.25±0.38)、(14.1±0.22)、(3.93±0.67)分，各组间比较差异均有统计学意义(F=0.589、5.215、8.223，P<0.05)。

三、血清DAO、D-乳酸水平的变化

假手术组、ANP组、infliximab组血清DAO水平分别为(87.88±34.51)、(146.30±12.99)、(115.00±18.58)μg/L，组间比较差异具有统计学意义(F=7.457、3.649、0.865，P<0.05)；D-乳酸水平为(1.50±0.49)、(2.32±0.35)、(2.02±0.25)mmol/L，各组间比较差异均有统计学意义(F=0.345、4.079、4.797，P<0.05)。

四、小肠病理改变及小肠推进率

造模24 h后，假手术组仅见肠道黏膜轻度水肿；ANP组肠道黏膜结构破坏，绒毛上皮水肿，可见局部上皮脱落及溃疡形成，黏膜间质固有层毛细血管及淋巴管扩张，血管内可见积聚的红细胞，并见少量圆形细胞浸润；infliximab组肠黏膜改变程度较ANP组显著减轻(图1)。假手术组、ANP组、infliximab组大鼠小肠组织病理评分分别为(2.29±0.32)、(6.61±0.58)、(3.91±0.41)分，各组间比较差异具有统计学意义(F=0.305、0.026、0.147，P<0.05)；小肠推进率分别为(0.64±0.04)%、(0.28±0.08)%、(0.52±0.09)%，各组间比较差异也均有统计学意义(F=1.586、3.889、0.316，P<0.05)。

图1假手术组(a)、ANP 组(b)、infliximab组(c)大鼠小肠病理改变 (HE ×10)

讨 论

ANP是一个全身炎症反应过程，早期的内毒素血症刺激TNF-α释放。TNF-α作为一种炎症启动因子，促进多种细胞因子产生[6]，致使肠黏膜细胞因缺血、缺氧、炎症介质和细胞因子等因素而发生损伤，肠道屏障通透性升高，肠道内细菌及毒素通过受损的肠黏膜屏障发生易位，导致全身炎症反应综合征(SIRS)，引起坏死的胰腺组织继发感染和多器官功能不全[7]。DAO存在于哺乳动物的黏膜上层和绒毛上层细胞内，主要位于小肠黏膜，血中含量极低；而D-乳酸是细菌发酵的代谢产物，哺乳动物不具备将其分解代谢的酶系统。当肠黏膜通透性增加时,DAO及肠道中细菌产生的大量D-乳酸通过受损黏膜入血,故监测血中DAO和D-乳酸水平可及时反映肠黏膜损害程度和通透性变化，成为肠黏膜损害的重要指标[8-9]。

Infliximab为TNF-α的单克隆抗体，可抑制TNF-α的生理活性，阻止其诱导的瀑布样级联炎症反应[10]。我们前期的研究显示，建模后6 h使用infliximab可有效抑制TNF-α介导的SIRS、减轻胰腺炎症和降低MODS发生率[11]。本实验结果进一步显示，infliximab可显著减轻小肠病理损伤，增加ANP大鼠的小肠推进率、降低ANP大鼠血清DAO及D-乳酸水平，提示在抗炎症介质治疗窗口期应用infliximab有利于减轻TNF-α介导的肠道炎性反应，改善肠动力，减轻肠屏障损害，对ANP时的肠道屏障功能起保护作用。

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[11] 贾林，陈奕金，黄耀星，等.重症急性胰腺炎大鼠模型腹腔内压和血TNF-α的时相改变及规律. 中华胰腺病杂志，2010，10 ：106-108.

Infliximabonintestinalbarrierinjureinratswithacutenecrotizingpancreatits

OUYa,JIALin,QIUJua-hua,LIWei-dong,HUANGYao-xing,NIEYu-qiang.
DepartmentofGastroenterology,FirstMunicipalPeople′sHospitalofGuangzhou,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510180,China

JIALin,Email:jialin@medmail.com.cn

ObjectiveTo evaluate the effects of infliximab (TNF-α monoclonal antibody) on intestinal barrier injury in ANP complicated with MODS in a rat model.MethodsThirty SD rats were randomly divided into sham operation group (SO), ANP group and infliximab treatment group. Sodium taurocholate (4.5%) was injected into the pancreatic duct to induce ANP complicated with MODS model. Infliximab (8 mg/kg) was injected via tail vein in 6h after modeling in infliximab group. Same amount of 0.9% NS was injected into the pancreatic duct in SO group. After 24 h of modeling, all rats were sacrificed, intestine and pancreas samples were collected for pathologic examination. The blood samples were harvested. The serum levels of amylase, TNF-α, diamine oxidase(DAO), D-lactate, and the rate of carbon propelling in ileum were measured.ResultsThe serum levels of amylase were (1125±331), (11024±2203), (545±30)U/L in SO group, ANP group and infliximab group; the serum levels of TNF-α were (12.1±4.0), (107.6±18.5), (75.8±5.9)U/L; the pathological scores of pancreas were 2.25±0.38, 14.10±0.22, 3.93±0.67, the difference among the 3 groups was statistically significant (P<0.05). The pathological scores of intestine were 2.29±0.32, 6.61±0.58, 3.91±0.41; the DAO levels were (87.88±34.51),(146.30±12.99), (115.00±18.58)ng/ml; the D-lactate levels were (1.50±0.49), (2.32±0.35), (2.02±0.25)mmol/L; and the rates of carbon propelling in ileum were (0.64±0.04)%, (0.28±0.08)%, (0.52±0.09)%, the difference among the 3 groups was statistically significant (P<0.05).ConclusionsInfliximab can effectively prevent dysfunction of intestinal barrier and improve motility in ANP rats.

Pancreatitis, acute necrotizing; Tumor necrosis factor-alpha; Monoclonod antibodies; Infliximab; Intestinal barrier function

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.015

广东省中医药局科研课题(008006)、广州市中西医结合科研课题(2008A02)

510180 广州医学院附属广州市第一人民医院消化内科

贾林，Email:jialin@medmail.com.cn

2011-04-25)

(本文编辑：屠振兴)